第12章转基因生物和基因打靶

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1、第十二章转基因生物和基因打靶第一节 转基因动物一、转基因动物（transgenic animal）：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳 定传代的一类动物。二、转基因动物的基本原理：是将目的基因（或基因组片段）用显微注射等方法注入实验动物的受精 卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因接合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体 动物的输卵管（或子宫）中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物。转基因技术中所用的外源基因是由顺式作用元件和结构基因组成的完整基因（即完整的转录单位）。 由于哺乳动物之间基因的同源性较高，为了检测方便，有时需引入报告基因（reporter ge

2、ne）或报告序列 （reporter sequence）构建外源基因时，可选择适当的顺式作用元件拼接；也可以将特定的目的基因与 报告基因拼接成融合基因（fusion gene），并与顺式作用元件拼接成完整的基因。顺式作用元件主要选用 有较高表达活性的强启动子（有时包括增强子），或者直接选用目的基因的天然启动子序列。目的基因可来 自基因组片段或cDNA序列。三、基本方法：导入基因的方式主要有显微注射法、胚胎干细胞法和逆转录病毒感染法。线性DNA和 环状DNA均可用于显微注射，但线性DNA整合效率比超螺旋DNA高出数倍，因为线性DNA可以首尾相连， 然后整合到染色体上。外源DNA的纯度亦十分重要。

3、1. 显微注射（microinjection）是目前最常用的转基因方法之一。用显微注射针将外源基因直接注入 实验动物受精卵的原核，使外源基因整合入动物基因组中，从而得到转基因动物。受精卵经显微注射后，约有60%左右的卵存活，由此发育成的小鼠中，有10%-40%的小鼠整合有外源 基因：其中80%的基因整合发生在单细胞期，成为典型的转基因动物；20%在细胞分裂后整合，这部分动物 并不是所有细胞中都有外源基因，称为嵌合动物（chimeric animal）。外源DNA整合的拷贝数从一至数百 个不等，一般情况下在染色体的单个位点整合，有时可能在不同染色体的不同位点整合。2. 胚胎干细胞（embryon

4、ic stem cells，ES细胞），是从着床前的动物胚胎中分离获得的一种多功能 胚胎干细胞。由于它注射入动物囊胚后可参与宿主的胚胎构成，形成嵌合体，直至达到种系嵌合，因此， 可将其作为一种载体，把外源基因导入个体，获得转基因动物ES细胞可通过磷酸钙-DNA共沉淀法、逆转 录病毒感染或电穿孔等方法转染，然后进行筛选和克隆。对ES细胞可进行的基因操作包括基因转移（引入 新基因）、基因突变（通过插入突变或同源重组定点突变）和基因改造（对ES细胞的基因组定位修复或修 饰）。3. 逆转录病毒感染法将外源基因与逆转录病毒载体在体外构建成重组逆转录病毒载体，然后将其 转染包装细胞，这时，既可以收获重组病

5、毒颗粒，用于早期胚胎的转染，又可以将胚胎直接加入包装细胞 培养物中共培养进行转染。转染后的胚胎可移植给假孕动物完成发育过程。4. 精子载体法 通过DNA与精子共育法、电穿孔法和脂质体转染法获得吸附有外源DNA精子，然后利 用其进行受精，将外源DNA导入卵细胞中，经过胚胎的发育，获得整合有外源DNA的转基因个体。转基因动物中外源DNA的检测 从转基因个体组织中提取基因组DNA进行斑点杂交、Southern杂交和 PCR分析等，以确定转基因动物中是否整合了外源DNA以及整合的拷贝数；还可以利用染色体原位杂交技 术进行外源基因整合位点的检测。其次是转录水平的检测。利用Northern杂交、RNase

6、保护分析及RT-PCR 方法检测转基因mRNA的存在及表达水平。最后是蛋白质水平的检测，主要是采用Western印迹分析的方法。第二节 转基因植物应用转基因技术培育成功的携带外源基因并能稳定遗传的植物就是转基因植物（transgenic plant）。 转基因植物具有广阔的应用前景，被称作“绿色工厂”。一、基本方法：转基因植物的技术路线为：选择及获得外源目的基因，将目的基因克隆到表达载体上； 受体细胞培养，如培养愈伤组织、悬浮细胞、无菌苗等；选用适当的转基因方法将目的基因导入受体 细胞，可以用纯化的表达载体直接转化；也可先用载体转化农杆菌，再以农杆菌转化受体细胞；将转化 细胞进行适当培养；筛选

7、阳性转化细胞；培植阳性转化植株；转基因植株的鉴定。目的基因可来自于植物本身，如抗旱基因；也可来自微生物和动物，如乙肝表面抗原、动物抗体等。 利用生物及物理化学等手段，将外源基因导入植物细胞以获得转基因植株，此过程即为植物的遗传转化。 近年来，巳建立了多种植物的遗传化系统，其中最常用的是农杆菌为介导的基因转移方法。另外，植物DNA 病毒介导的基因转移、电击法、基因枪法、显微注射法、脂质体介导法、多聚物介导法、激光微束穿孔法 等DNA的直接转移法也常用于植物基因工程。应用一些抗生素抗性基因及抗除草剂基因等筛选标记和报告基因。可对转化植物细胞及转基因植物进 行筛选和鉴定，也可经Southern印迹、

8、Western印迹等分子生物学技术直接对转基因植物中的外源基因及 其表达产物进行检测。二、转基因植物在医学上的应用：1、用植物基因工程技术生产药用蛋白为生物技术开辟了新的领域，极有 希望成为药用蛋白的主要来源和生产方法。2、转基因植物亦可成为新的疫苗来源，特别是适合作为口服疫 苗。3、转基因植物还可以生产单抗。三、转基因植物的安全性探讨。第三节基因打靶基因打靶(gene targeting)：是指通过DNA定点同源重组，改变基因组中的某一特定基因，从而在 生物活体内研究此基因的功能。若定向敲除某个基因，称为基因敲除(gene knockout)；若定向将一段基 因序列替代另一段基因序列，则称为

9、基因敲入(gene knockin)。一、基因打靶的必备条件1. 胚胎干细胞ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团，即小鼠受精卵发育第4、5天的胚泡细胞。 ES细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。将ES细胞进行体外遗传操作后，重新植回小鼠胚胎，可发育成胚胎的各种组织，最后形成嵌合体小鼠(chimeric mouse)。如果这种ES细胞能发育成小鼠的生殖细胞，通过交配就可得到基 因敲除或敲入小鼠。2. 打靶载体打靶载体含有两种筛选标志：neo (新霉素)阳性筛选标志：HSV-tk阴性筛选标志。(1) neo阳性筛选标志：将neo基因插入用于打靶的外源DNA中。当外源DNA与细胞染色体上的

10、同 源序列发生同源重组时，neo基因也被插入到染色体，因此，发生同源重组的ES细胞能在含 G418的培养基中生长。(2) HSV-tk阴性筛选标志：当外源DNA与细胞染色体上的同源序列发生同源重组时，载体部分(含 HSV-tk基因)是不能被整合到染色体听。如果细胞能在含单核苷酸类似物(如氨基蝶蛉、次黄 嘌吟)的培养基上生长，说明载体部分亦重组到染色体中：相反，如ES细胞在此种培养基中 被杀死，说明载体部分没有插入基因组。基因敲除：通过DNA同源重组，使得ES细胞特定的内源基因被破坏而造成其功能丧失，然后通过ES细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。二、基因敲除的基本程序包括构建打

11、靶载体、ES细胞的体外培养、重组载体转染ES细胞、重组体转染的ES细胞的鉴定、ES 细胞胚胎移植和嵌合体杂交育种。1. 打靶载体的构建 首先要获得与ES细胞相同品系的基因片段作为同源片段插入载体，并在载体上插入 筛选标记基因。基本过程为：获得目的基因(待敲除基因)的同源片段，将此DNA片段克隆到一般 的质粒载体中；从重组质粒中切除目的基因的大部分同源DNA序列，只留部分序列在线性质粒载体 的两端；将neo基因克隆到带有目的基因同源顺序的线性质粒中，使之位于残留目的基因同源顺序 的中间；在目的基因同源顺序的外侧线性化重组质粒载体，将HSV-tk基因克隆到此线性载体中。这 种由部分残留的待敲除基因

12、的同源片段、位于其内部的neo基因和位于其外侧的HSV-tk基因共同构成载体即为打靶载体。2. 打靶载体导入ES细胞 一般多采用显微注射法将打靶载体导入，细胞。3. 基因敲除ES细胞注射入细胞 将基因敲除ES细胞注射入胚胎中，使其与原胚泡中的细胞共同组成胚 泡的内细胞团。4. 胚泡植入假孕小鼠的子宫中 将含有基因敲除ES细胞的胚泡移植到假孕小鼠的子宫腔中，使ES细胞 有机会发育成小鼠或某种组织。这种胚泡中既含有基因敲除ES细胞，又含有胚泡原有的正常ES细胞， 因此，这种胚泡发育所产生的后代中有源于基因敲除ES细胞的小鼠，也有源于正常细胞的小鼠。5. 嵌合体的杂交育种 对后代小鼠进行筛选，可以得到基因敲除的嵌合体小鼠。一般认为，基因的同源 重组只发生在一条染色体上，当一条染色体上的同源基因被同源顺序置换后，另一条染色体上的等位 基因不再发生置换，因此经同源重组后只能得到嵌合体。然后经过杂交育种，按盂德尔遗传规律，其 后代中有1/4的几率为纯合子，这样经过将嵌合体小鼠与正常小鼠进行交配，就可得到基因敲除的纯 系小鼠，即基因敲除小鼠。三、基因打靶在医学中的应用。