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1、实验三：影响神经冲动传导的因素观察实验目的：1继续学习蟾蜍坐骨神经-腓神经标本制备方法，掌握坐骨神经标本的制备方法。2引导蟾蜍坐骨神经动作电位，并观察其基本波形（包括双相和单相动作电位）。3学习和掌握神经干动作电位传导速度测定的原理和方法。4设计改变细胞外液的某些因素会对动作电位在神经干上传导的速度产生何种影响？实验原理：蛙类的一些基本生命活动和生理功能与恒温动物相似，若将蛙的神经-肌肉标本放在任氏液中，其兴奋性在几个小时内可保持不变。若给神经或肌肉一次适宜刺激，可在神经和肌肉上产生一个动作电位，肉眼可看到肌肉收缩和舒张一次，表明神经和肌肉产生了一次兴奋。在生理学实验中常利用如果将两个引导电极
2、置于正常完整的神经干表面，当神经干的一端兴奋之后，兴奋波会先后通过两个引导电极(r1r1,图5坐骨神经干包括多种类型的神经纤维成分，因此记录到的动作电位是它们电位变化的总和，因此神经干动作电位是一种复合动作电位。由于各类神经纤维的兴奋阈值各不相同，所以记录到的动作电位幅值在一定范围内可随刺激强度的变化而改变，这一点不同于单根神经纤维的动作电位。动作电位在神经纤维上的传导有一定的速度。不同类型的神经纤维动作电位传导速度各不相同。蛙类坐骨神经干中以A类纤维为主，传导速度(V)大约为3540 m/s。测-腓肠肌标本的制备，但无需保留股骨和腓肠肌。坐骨神经干要求尽可能长些。在脊椎附近将神经主干结扎，剪
3、断。提起线头剪去神经干的所有分支和结缔组织，到达腘窝后，可继续分离出腓神经或胫神经，在靠近趾部剪断神经。将制备好的神经标本浸泡在任氏液中数分钟，待其兴奋性稳定后开始实验。3仪器及标本的连结（1）用浸有任氏液的棉球擦拭神经标本屏蔽盒上的电极，标本盒内放置一块湿润的滤纸片，以防标本干燥。用滤纸片吸去标本上过多的任氏液，将其平搭在屏蔽盒的刺激电极、接地电极和引导电极上，并且使其近中端置于刺激电极上，远中，频率816 Hz，波宽0.10.2 ms，强度根据标本兴奋性而定，由小增大(一般可选2V)。示波器灵敏度0.10.5 V/cm，扫描速度12 ms/cm。外触发输入接刺激器的触发输出端。触发选择置于
4、外触发同步。开启电子刺激器时，调节触发电平旋钮，使示波器扫描与刺激输出同步。将扫描线调至荧光屏中间。（3）若使用计算机生物信号采集处理系统进行实验则参照图5.5-2连接仪器。两对记录电极分别连接到CH1、CH2通道，刺激电极连接到刺激输出。打开计算机，启动生物信号采集处理系统，进入“神经干动作电位”模拟实验菜单。4观测和测定双相值时的阈刺激。（2）增大刺激强度的过程中，伪迹和动作电位均随之加大，但当强度加大到某一程度后(此刺激强度称为最大刺激)，动作电位就不再增大，而伪迹仍随之加大。这是区别刺激伪迹与动作电位的可靠方法之一。（3）仔细观察双相动作电位的波形(图5.5-3)。读出最大刺激时双相动
5、作电位上下相的振幅和整个动作电位持续时间数值。（4）将神经干标本放置的方向倒换后，双相动作电位的波形有无变化？（5）将两根引导电极r1,r1的位置调换，动作电位波形有和变化？5观察单相动作电位 用镊子将两个引导电极r1,r1之间的神经夹伤，或用一小块浸有3 mol/L KCl溶液的滤纸片贴在第二个引导电极(r1)处的神经干上，再刺激时呈现的即是单相动作电位。读出最大刺激时单相动作电位的振幅值和整个动作电位持续的时间数值。6动作电位传导速度的测定换一根坐骨神经，按步骤3（1）搭放在神经屏蔽盒的电极上。进入“神经干动作电位传导速度”模拟实验菜单，或在显示方式菜单中选择“比较显示方式”（则可在一个通
6、道内显示两个通道的图形）。给予神经干最大刺激强度，可在两个通道中（或示波器的上、下线）观察到先后形成的两个双向动作电位波形。（1）分别测量从刺激伪迹到两个动作电位起始点的时间，设上线为t1，下线为t2(或可直接测量两个动作电位起点的间隔时间)，求出t2t1的时间差值。（2）测量标本屏蔽盒中两对引导电极相应的电极之间的距离d(即测定r1r2的间距)。（3）将神经干标本置于4的任氏液中浸泡5 min后，再测定神经冲动的传导速度。（4）参照上步操作可自行设计改变细胞外液的某些因素，如分别将神经干标本置于25的任氏液、高钾和低钠任氏液中浸泡5 min后，再测定神经冲动的传导速度。实验结果：1分别计算正
7、常的神经干和低温浸泡后的神经干上动作电位传导速度Vd/(t2t1)(m/s)。2对全部各组的实验结果加以统计，用平均值标准差表示。注意事项：1避免蟾蜍体表毒液和血液污染标本，压挤、损伤和用力牵拉标本，不可用金属器械触碰神经干。2在操作过程中，应给神经和肌肉滴加任氏液，防止表面干燥，以免影响标本的兴奋性。3制备标本时，神经纤维应尽可能长一些，将附着于神经干上的结缔组织膜及血管清除干净，但不能损伤神经干。标本制成后须放在任氏液中浸泡数分钟,使标本兴奋性稳定,再开始实验效果会较好。4各仪器应妥善接地，仪器之间、标本与电极之间应接触良好。5经常滴加任氏液，保持神经标本湿润，但要用滤纸片吸去神经干上过多
8、的任氏液。神经干不能与标本盒壁相接触，也不要把神经干两端折迭放置在电极上，以免影响动作电位的波形。6测定动作电位传导速度时，两对引导电极间的距离应尽可能大。思考题：1什么叫刺激伪迹，是怎样发生的？怎样鉴别刺激伪迹和神经干动作电位？2神经被夹伤或经KCl溶液处理后，动作电位的第二相为何消失?3神经干动作电位与刺激强度有何关系？它与神经动作电位的 “全或无”特性有矛盾吗？为什么? 4引导电极调换位置后，动作电位波形有无变化?为什么? 5为什么不用从刺激电极的阴极到第一个引导电极的距离除以t1直接计算神经动作电位传导速度?用一对引导电极能否测定神经动作电位传导速度?6根据你的结果可推断蛙的坐骨神经干
9、中的神经纤维主要属于那种类型的？7将神经干标本置于4的任氏液中浸泡后，神经冲动的传导速度有何改变?为什么?附： 1刺激伪迹 逐渐增大刺激强度时，在屏幕的左侧基线上第一个波即为伪迹，其波形、幅度、宽度和位置可分别由刺激器的强度、延迟和渡宽调节钮控制。它的产生机制有二，一是通过刺激电极与记录电极之间的电容偶合进入放大器，二是通过细胞膜的电缆效应偶合进入放大器。伪迹可以做为刺激时刻的标志和刺激器、示波器功能状态的标志。但伪迹太大，会使动作电位发生畸变。2细胞膜的电缆学说 细胞外液和细胞内液均为含电解质的液体，可以看作为两个导体引起的膜电位改变时，发现：在电源附近电位上升快，达到的最高电位也较大；离开
10、电源越远，则不但电位上升的慢，而且最终的最高电位也较低。电位改变变慢，是膜电容引起的后果；电位依距离变小，是膜外电阻、膜电阻及膜内电阻引起的后果。3双极记录法 本实验使用的记录方法为双极记录法，所记录到的电位变化，为两个电极之间的相对电位，并不代表电极下的真实电位，而是其代数和。另外，本法又是一种细胞外记录的方法，测得的电位也不代表细胞内的电位，只反映了膜外电位的改变。4刺激的极性法则 以直流电作用于神经时，在通电、断电时均可产生兴奋，而且通电时的兴奋发生在阴极，断电时的兴奋发生在阳极，这称为极性法则。在直流电通电过程中，阴极下神经组织的兴奋性升高，称为阴极电紧张。是通电时发生兴奋的原因；阳极
11、下的兴奋性降低，称为阳极电紧张断电后，阴极下的兴奋性降低，称为阴极后压抑；阳极下的兴奋性升高，称为阳极后加强，是断电时发生兴奋的原因，通常所说的刺激发生在阴极下，刺激时阴极下的外向电流，指的就是通电的情况而言的。 5记录介质 通常所说双相动作电位的波形，其记录介质是空气或油。若神经干浸在细胞外液中，则记录到的波形为三相波。因此实验时，不可在神经干上滴过多的任氏液。 实验四：蛙类离体心脏灌流及药物影响（综合设计性实验）实验目的：1学习离体蛙心灌流的实验方法，了解离体器官的研究方法。2观察内环境理化因素相对稳定对维持心脏正常节律性活动的重要作用，了解肾上腺素、乙酰胆碱等激素、神经递质对心脏活动的调
12、节意义。3观察强心甙、中草药提取物和一些临床治疗药物对离体蛙心的直接作用。实验原理：心脏正常的节律性活动必须在适宜的理化环境中进行，一旦适宜的环境被破坏，例如酸碱度及离子浓度的急剧改变等，心脏的活动就会受到影响。在整体内，心脏的活动受自主神经的双重支配，交感神经兴奋时，其末梢释放去甲肾上腺素，使心肌收缩力量增强，心率加快；而迷走神经兴奋时，其末梢释放乙酰胆碱，使心肌收缩力量减弱，心率减慢。强心甙类药物能够增强心肌收缩能力，减慢心率。动植物提取物对心脏功能的影响与其内部所含物质的成份有关。动物与器材：蛙或蟾蜍,蛙心套管,套管夹,支架，双凹夹,滑轮,烧杯,常用手术器械,蛙板,蛙心夹,计算机采集系统
13、,张力传感器,滴管,培养皿,污物缸,纱布,棉线,橡皮泥,任氏液,0.65% NaCl，1%CaCl2，1%KCl，3%乳酸，2.5%NaHCO，1:5000肾上腺,1;10000乙酰胆碱,300U/ml肝素，强心药物，中草药提取物等等。方法与步骤：1取一只蛙或蟾蜍,双毁髓后背位于蜡盘中,仔细识别心脏周围的大血管。在左动脉下方穿一线,于动脉圆锥处结扎,再从左右两动脉下方穿一线,并打一活结备用。左手提起主动脉上时结扎线,右手用眼科剪再结扎线下方,沿向心方向将动脉上壁剪一斜口。取一带线的蛙心夹在心室收缩时夹住心尖。选择大小适宜的蛙心套管,然后将盛有少量任氏液的斯氏蛙心套管,由开口处插入动脉圆锥.当套
14、管进到大动脉圆锥基部时,应将套管稍稍后退,提取蛙心夹连线并使蛙心套管尖端向动脉圆锥的背部后下方及心尖方向推进,经动脉瓣插入心室腔内。此时可见套管中血液冲入套管,并使液面随心脏的波动而上下移动,表明操作成功。用滴管吸去套管中的血液,更换新鲜任氏液。稳定套管后,轻轻提起备用线,将左右动脉连同插入的套管用双结扎紧(不得漏液),再将结线固定在套管的小玻璃钩上,然后剪断结扎线上方的血管。轻轻提起套管和心脏,看清静脉窦的位置,与静脉窦下方剪断有牵连的组织,仅保留静脉窦和心脏联系,使心脏离体。用任氏液反复冲洗心室内余血,使血管内灌流液不再有残留血液,保持套管内液面高度一致,进行实验。2将插好的离体心脏套管固
15、定在支架上,用蛙心夹住少许的心尖部肌肉.再将蛙心尖上的系线绕过一个滑轮与张力传感器相连。注意:勿使灌流液滴到张力传感器上,调节显示器的心脏收缩的曲线幅度适中。3实验观察描计一段正常心搏曲线，注意观察心跳频率和强度以及心脏的收缩、舒张程度。4. 实验项目设计及结果观察（1）温度对无机离子蛙心活动的影响A、把蛙心套管内任氏液全部换为0.65%NaCl溶液，观察心跳变化。B、把0.65%NaCl溶液吸出，换以任氏液，加入1%CaCl2溶液12滴，观察心跳变化。C、把含1%CaCl212滴的溶液吸出，换以任氏液，加入1%KCl溶液12滴，观察心跳变化。D、把含KCl的溶液吸出，换以任氏液，加入0.01%肾上腺素溶液23滴，观察心跳变化。（2）递质和激素对蛙心活动的影响A、把含肾上腺素的溶液吸出，换以任氏液，加入0.01%乙酰胆碱溶液12滴，观察心跳变化。B、把含乙酰胆碱的溶液吸出，换以任氏液，加入3%乳酸溶液12滴，观察心跳变化。待心跳变化明显时，立即加入2.5%NaHCO3溶液12滴，观察心跳逐步恢复。（3）心血管药物对蛙心活动的影响制备如心得安、异丙肾上腺素和毒K等化合物制剂参照以上方法依次，观察实验结果。（4）观察自己提取的植物制剂和人民常饮用的化合物对例题蛙心的活动影响中草药：夹竹桃叶、蟾酥、蛙皮素、烟叶、茶叶等。有机化合物：
