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1、货号：MS2000规格：100管/96样乙酰胆碱酯酶（AchE ）活性测定试剂盒说明书微量法注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：AchE属于丝氨酸水解酶，广泛存在于各种动物组织和血清中。AchE催化乙酰胆碱（Ach） 水解，在神经传导调节中起重要作用。测定原理：AchE催化Ach水解生成胆碱，胆碱与二硫对硝基苯甲酸（DTNB）作用生成5-巯基-硝基苯 甲酸（TNB）； TNB在412nm处有吸收峰，通过测定412 nm吸光度增加速率，计算AchE活性。自备实验用品及仪器：可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、低温离心机、水浴锅、可调式移液 枪和蒸馏水。
2、试剂组成和配制：试剂一：液体X1瓶，4C保存。试剂二：液体X1瓶，4C避光保存。试剂三：粉剂X1瓶，4C避光保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。试剂四：粉剂X1支，4C保存。临用前加入1.3 mL试剂二，充分震荡溶解。粗酶液提取：1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1： 510的比例（建议称取约0.1g组织，加 入1mL试剂一）进行冰浴匀浆，8000g 4C离心 10min，取上清液待测。2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为5001000： 1的比例（建议500 万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔
3、7秒，总时 间3min）；然后8000g，4&离心10min，取上清置于冰上待测。3. 血清等液体：直接测定。测定操作：1. 分光光度计/酶标仪预热30 min，调节波长到412 nm，蒸馏水调零。2. 试剂二置于37C水浴中预热30min。3. 取微量石英比色皿/96孔板，依次加入20p L上清液、160 p L试剂二、10 L试剂三和10p L 试剂四，迅速混匀，于412nm处测定3min内吸光值变化，第10s吸光值记为A1，第190s吸 光值记为A2OAA测定管二A2-A1。注意：空白管只需测定一次。AchE活性计算：a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下1. 组织AchE活性（1）按
4、照蛋白浓度计算活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/min/mg prot）= （AAS 4-dX V 反总 X109）：（Cpr XV 样）：T=245XAACpr（2）按照样本质量计算活性单位定义：每克组织每分钟催化产生Inmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/min/g 鲜重）=（AAS :dXV 反总 X109）：（W XV 样：V 样总）：T=245XAA：W2. 细菌、细胞AchE活性活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生Inmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/m
5、in/104cell）= （AA：S :dX V 反总 X109）：（细胞数量XV 样：V 样总）：T =245XAA：细胞数量3. 血清AchE活性活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/min /mL）= （AA：S :dX V 反总 XIO9）：V 样：T=245XAAS ： TNB摩尔消光系数，13.6X103 L/mol/cm； d：比色皿光径，1 cm； V反总：反应体系总体 积（L）, 200p L=2X10-4L； V 样总：提取液体积，1 mL； 106：1mol=1X1Oep mol； Cpr:蛋白 浓度（mg
6、/mL）； V样：加入上清液体积（mL）, 0.02 mL； W :样品质量；T：反应时间（min）, 3 min。b.使用96孔板测定的计算公式如下1. 组织AchE活性（1）按照蛋白浓度计算活性单位定义：每毫克蛋白每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/min/mg prot）= （AA：S :dX V 反总 X109）：（Cpr XV 样）：T=490XAA：Cpr（2）按照样本质量计算活性单位定义：每克组织每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/min/g 鲜重）二（AA：S :dXV 反总 X109）：（
7、W XV 样：V 样总）：T=490XAA：W2. 细菌、细胞AchE活性活性单位定义：每104个细胞每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/min/104cell）= （AA：S :dX V 反总 X109）：（细胞数量XV 样：V 样总）：T =490 XAA：细胞数量3. 血清AchE活性活性单位定义：每毫升血清每分钟催化产生1nmol TNB的酶量为1个酶活单位。AchE 酶活（nmol/min /mL）= （AA：S :dX V 反总 X109）：V 样：T=490XAAS ： TNB摩尔消光系数，13.6X103 L/mol/cm； d： 96孔板光径，0.5 cm； V反总：反应体系总 体积（L），200p L=2X10-4L； V 样总：提取液体积，1 mL； 106：1mol=1X106p mol； Cpr:蛋 白浓度（mg/mL）； V样：加入上清液体积（mL），0.02 mL； W :样品质量；T：反应时间（min）， 3 min。
