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1、 欢迎阅读本文档，希望本文档能够对您有所帮助！1 绪论 1.1 植物组织培养的一般概念 广义的组织培养，不仅包括在无菌条件下利用人工培养基对植物组织的培养，而且包括对原生质体、悬浮细胞和植物器官的培养。Gamborg曾根据所培养的植物材料的不同，把组织培养分为5种类型，即愈伤组织培养，悬浮细胞培养、器官培养(胚、花药、子房、根和茎的培养等)、茎尖分生组织培养和原生质体培养。其中愈伤组织培养是一种最常见的培养形式。 1.1 植物组织培养的一般概念 所谓愈伤组织，原是指植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。 愈伤组织培养
2、所以是一种最常见的培养形式，是因为除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终也都要经历愈伤组织才能产生再生植株，此外，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源 在组织培养中，当我们把分化组织中的不分裂的静止细胞，放在一种能促进细胞增殖的培养基上以后，细胞内就会发生某些变化，从而使细胞进入分裂状态。一个成熟细胞转变为分生状态的过程叫做脱分化 。 在组织培养中，我们把由活植物体上切取下来以进行培养的那部分组织或器官叫做外植体 一个成熟的植物细胞经历了脱分化后之所以还能再分化而形成完整的植株，是因为这些细胞具有全能性。所谓全能性，就是说，任何具有完整的细胞核的植物细胞，都拥有
3、形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。对已分化的细胞的全能性的实验研究表明，至少在某些情况下，发育和分化过程并不导致细胞中遗传信息的丢失或不可逆的钝化，所涉及的只是这些遗传信息表达调控机制的改变。 有关全能性的肯定实验证据是Steward等人(1958)在以胡萝卜根组织为外植体的组织培养实验中得到的。当他们把栽培胡萝卜次生韧皮部薄片培养在一种含有椰子汁的固体培养基上时，产生了由简单的薄壁细胞组成的愈伤组织。把这些愈伤组织转入到成分相同的液体培养基中并不断振荡，又产生了由单个细胞和小细胞团组成的悬浮液。 全能性只是一种可能性，由以上的介绍我们可以看到，要把这种可能性变为现实性必须满足两个条件：一
4、是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来，也就是说必须使这部分细胞处于离体的条件下，二是要给予它们适当的刺激，即给予它们一定的营养物质，并使它们受到一定的激素的作用。 一个已分化的细胞要表现它的全能性，必须经历上面所说的两个过程， 即首先要经历脱分化过程，然后再经历再分化过程。 脱分化是指植物在组织培养时，在激素调节下由成熟组织的细胞（如叶细胞）转变为分生状态的过程。 再分化是指在植物组织培养过程中，分生状态的细胞在激素的作用下分化转变为成熟组织或器官的过程。 脱分化后的细胞进行再分化的过程有两种不同的方式，一种是器官发生方式，其中茎芽和根是在愈伤组织的不同部位分别独立形成的，形成
5、的时间可能也不一致，它们为单极性结构，里面各有维管束与愈伤组织相连，但在不定芽和不定根之间并没有共同的维管束把二者连在一起， 另一种是胚胎发生方式，即在愈伤组织表面或内部形成很多胚状体，或称体细胞胚，它们经历的发育阶段与合子胚相似，成熟胚状体的结构也与合子胚相同。胚状体是双极性的，有共同的维管束贯穿两极，可脱离愈伤组织在无激素培养基上独立萌发。 一般认为，愈伤组织中的不定芽起源于一个以上的细胞，而体细胞胚只起源于一个细胞，因此由体细胞胚长成的植株各部分的遗传组成应当是一致的，不存在嵌合现象，不过也有些作者在这类再生植株中同样发现了嵌合现象，因此认为体细胞胚也起源于一个以上的细胞。 胚状体：在愈
6、伤组织形成以后，培养的细胞团中开始形成结构紧实，解剖结构类似于胚的单细胞来源的培养物。我们称之为胚状体。 在很多植物中，胚状体的结构都是相当典型的，但在有些植物如小麦中，幼龄胚状体的盾片往往变大变绿，形成通常所描述的“叶状结构”，并且常常出观早熟萌发的现象。 胚状体与不定芽的区别 最根本的特征是具有两极性，即在发育的早期阶段，从其方向相反的两端分化出茎端和根端，而不定芽或不定根都为单向极性。 胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系，而不定芽或不定根往往总是与愈伤组织的维管组织相联系。 胚状体的维管组织的分布是独立的“v”字形，而不定芽的维管组织无此现象胚状体与合子胚的比较合子胚胚
7、状体质量萌发率高，质量好萌发率低，质量差来源受精卵体细胞胚柄有，明显即使有也不明显形态固定，体积相对较小复杂，常有两个以上的子叶体积相对较大变异率低高 通过胚状体途径产生再生植株有3个显著的优点， 首先，在一个培养物上所能产生的胚状体数目往往比不定芽的数目多(例如在一个离体培养的烟草花药上可以产生200个以上的胚状体); 其次，胚状体形成的速度快， 第三，胚状体结构完整，一旦形成，一般都可直接萌发形成小植株，因此成苗率较高。12 植物组织培养的发展简史 虽然组织培养技术的蓬勃发展只是近五十年来的事，但它的整个历史可以追溯到十九世纪末和二十世纪初。 从那时起到现在，组织培养的发展过程大致可以分为
8、三个阶段： 本世纪初，在Schleiden和Schwann所发展起来的细胞学说的推动下，德国植物生理学家Haberlandt提出了高等植物的器官和组织可以不断分割，直至分到单个细胞的观点。 为了论证这一观点，他在加入了蔗糖的Knop溶液中培养单个离体细胞，所选用的材料是小野芝麻和凤眼兰的栅栏组织和虎眼万年青属植物的表皮细胞等。遗憾的是，虽然在栅栏细胞中他明显看到了细胞的生长、细胞壁的加厚和淀粉的形成等，但没有一个细胞在培养中能够发生分裂。 Haberlandt实验失败的原因，现在看来主要在于两点： 第一，他所选用的实验材料都是已经高度分化了的细胞， 第二，所用的培养基过于简单，特别是培养基中没
9、有包含诱导成熟细胞分裂所必需的生长激素，这是因为生长激素在当时还没有发现。 然而，做为植物组织培养的先驱者，Haberlandt的贡献不仅在于首次进行了离体细胞培养的实验，而且在其1902年发表的“植物离体细胞培养实验”的报告中，还提出了胚囊液在组织培养中的作用和看护培养法等科学的预见。 自Haberlandt的实验之后，直到1934年White培养番茄离体根尖的成功，在其间的32年时间里，植物组织培养技术几乎没有什么进展，只是在以下两个方面进行了一些初步的探索。 Laibach(1925，1929)把由亚麻种间杂交形成的不能成活的种子中的胚剖出，在人工培养基上培养至成熟，从而证明了胚培养在植
10、物远缘杂交中利用的可能性； 到了30年代中期，植物组织培养领域里出现了两个重要的发现，其一是，认识了B族维生素对植物生长的重要意义，二是发现了生长素是一种天然的生长调节物质。 导致这两个发现的主要是White和Gautheret的实验。1934年，White由番茄根建立了第一个活跃生长的无性系，使根的离体培养实验首次获得了真正的成功。起初，他在实验中使用的培养基包含无机盐、酵母浸出液和蔗糖。后来(1937)，他用3种B族维生素，即吡哆醇，硫胺素和烟酸，取代酵母浸出液获得成功。 在这个以后被称为White培养基的合成培养基上，他把某些于1934年建立起来的根培养物一直保存到1968年他逝世前不久
11、。与此同时，Gautheret(1934)在山毛柳和黑杨等形成层组织的培养中发现，虽然在含有葡萄糖和盐酸半胱氨酸的Knop溶液中，这些组织也可以不断增殖几个月，但只有在培养基中加入了B族维生素和IAA以后，山毛柳形成层组织的生长才能显著增加. 由于这些实验揭示了B族维生素和生长素的重要意义，又直接导致了1939年Gautheret连续培养胡萝卜根形成层获得首次成功。同年，White由烟草种间杂种的瘤组织，Nobecourt由胡萝卜，也建立了类似的连续生长的组织培养物。因此，Gautheret， White和Nobecourt一起被誉为植物组织培养的奠基人。 40年代和50年代初期，活跃在植物组
12、织培养领域里的研究者以Skoog为代表，研究的主要内容是利用嘌呤类物质处理烟草髓愈伤组织以控制组织的生长和芽的形成。 Skoog(1944)以及Skoog和崔澂等(1951)发现，腺嘌呤或腺苷不但可以促进愈伤组织的生长，而且还能解除培养基中生长素(IAA)对芽形成的抑制作用，诱导芽的形成，从而确定了腺嘌呤与生长素的比例是控制芽和根形成的主要条件之一。 这些实验结果导致了激动素的发现和以后利用激动素和生长素在组织培养中控制器官分化工作的开展。 在40年代，组织培养技术的另一项发展是Overbeek等(1941)首次把椰子汁做为补加物引入到培养基中，使曼陀罗的心形期幼胚能够离体培养至成熟。到50年
13、代初，由于Steward等在胡萝卜组织培养中也使用了这一物质，从而使椰子汁在组织培养的各个领域中都得到了广泛应用。 50年代开始以后，植物组织培养的研究日趋繁荣，10年当中引入注目的进展就有以下6项： 1952年，Morel和Martin首次证实，通过茎尖分生组织的离体培养，可以由已受病毒侵染的大丽花中获得无毒植株 19531954年，Muir进行单细胞培养获得初步成功。方法是把万寿菊(Tagetes erecta)和烟草的愈伤组织转移到液体培养基中，放在摇床上振荡，使组织破碎，形成由单细胞和细胞聚集体组成的细胞悬浮液，然后通过继代培养进行繁殖。Muir等还用机械方法由细胞悬浮液和容易散碎的愈
14、伤组织中分离得到单细胞，把它们置于一张铺在愈伤组织上面的滤纸上培养，使细胞发生了分裂。这种“看护培养”技术揭示了实现Haberlandt培养单细胞这一设想的可能性。 1955年，Milier等由鲱鱼精子DNA中分离出一种首次为人所知的细胞分裂素，并把它定名为激动素(kinetin)。现在，具有和激动素类似活性的合成的或天然的化合物已有多种，它们总称为细胞分裂素(cytokinin)。应用这类物质，我们就有可能诱导已经成熟和高度分化的组织(如叶肉和干种子胚乳)的细胞进行分裂。 1957年，Skoog和Miller提出了有关植物激素控制器官形成的概念，指出在烟草髓组织培养中，根和茎的分化是生长素对
15、细胞分裂素比率的函数， 通过改变培养基中这两类生长调节物质的相对浓度可以控制器官的分化：这一比率高时促进生根，低时促进茎芽的分化，二者浓度相等时，组织则倾向于以一种无结构的方式生长 1958年，Wickson和Thimann指出，应用外源细胞分裂素可促成在顶芽存在的。 后来，Murashige发展了这一方法，制订了一系列标准程序，把这一方法广泛用于由蕨类植物到花卉和果树的快速繁殖上。 19581959年，Reinert和Steward分别报道，在胡萝卜愈伤组织培养中形成了体细胞胚。这是一种不同于通过芽和根的分化而形成植株的再生方式。现在知道有很多物种都能形成体细胞胚。在有些植物如胡萝卜和毛茛中，事实上由植物体的任何部分都可以得到体细胞胚。 60年代以来组织培养技术所以得到了迅速发展， 一方面是由于有了前60年建立的理论和技术基础， 另一方面是由于这项技术开始走出了植物学家和植物生理学家的实验室，通过与常规育种、良种繁育和遗传工程技术相结合，在植物改良中发挥了重要的作用，并且在若干方面已经取得了可观的经济效益。60年代以来组织培养技术的发展，概括起来可以分为三个方面：(1)原生质体培养取得重大突破 1960年，Cocking等人用真菌纤维素酶分离植物原生质体获得
