叶绿素理化性质的测定

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1、一、原理 叶绿素是一种二羧酸一叶绿酸与甲醇和叶绿醇形成的复杂酯，故可与碱起皂化反应而生成醇（甲醇和叶绿醇）和 叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水中，可用此法将叶绿素与类胡萝卜素分开；叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性， 表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定；叶绿素吸收光量子而转变成激发态，激发态 的叶绿素分子很不稳定，当它变回到基态时可发射出红光量子，因而产生荧光。叶绿素的化学性质很不稳定，容 易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后，破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。叶绿素中的镁可以被 H+所取代而成褐色的去镁叶绿素，后者遇铜则成为绿色的铜代叶绿素，铜代叶绿素很稳定，在光下

2、不易破坏，故 常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。皂化反应式如下：/ COQCHjCOOK+ 2K0H 皿& + CH3QH +。为日龄。日KX：20H3g叶绿素帛化叶绿素甲牌 叶嫌障二、仪器与用具20ml刻度试管；10ml小试管；试管架；分光镜；石棉网；药匙；烧杯（100ml）；酒精灯；玻棒；铁三角架；刻 度吸量管2ml、5ml各1支；火柴。三、试剂1. 95%乙醇；苯；醋酸铜粉末；5%的稀盐酸；2. 醋酸-醋酸铜溶液：6g醋酸酮溶于100ml 50%的醋酸中，再加蒸僧水4倍稀释而成；3. KOH-甲醇溶液：20g KOH溶于100ml甲醇中，过滤后盛于塞有橡皮塞的试剂瓶中。四、方法用叶绿体

3、色素乙醇溶液和水研磨匀浆，进行以下实验。1. 光对叶绿素的破坏作用（1）取4支小试管，其中两支各加入5ml用水研磨的叶片匀浆，另外两支各加入2.5ml叶绿体色素乙醇提取液， 并用95%乙醇稀释1倍。（2）取1支装有叶绿素乙醇提取液的试管和1支装有水研磨叶片均浆的试管，放在直射光下，另外两支放到暗 处，40min后对比观察颜色有何变化，解释其原因。2. 荧光现象的观察取1支20ml刻度试管加入5ml浓的叶绿体色素乙醇提取液，在直射光下观察溶液的透射光与反射光颜色有何不 同？解释原因。3. 皂化作用（绿色素与黄色素的分离）（1）在做过荧光现象观察的叶绿体色素乙醇提取液试管中加入1.5ml 20%K

4、OH-甲醇溶液，充分摇匀。（2）片刻后，加入5ml苯，摇匀，再沿试管壁慢慢加入11.5ml蒸僧水，轻轻混匀（勿激烈摇荡），于试管架 上静置分层。若溶液不分层，则用滴管吸取蒸僧水，沿管壁滴加，边滴加边摇动，直到溶液开始分层时，静置。 可以看到溶液逐渐分为两层，下层是稀的乙醇溶液，其中溶有皂化的叶绿素a和b （以及少量的叶黄素）；上层 是苯溶液，其中溶有黄色的胡萝卜素和叶黄素。4. 吸收光谱的观察将上述已分层的试管溶液，用分光镜观察两类色素的吸收光谱，首先让下层绿色素部分对准进光孔，看光谱有何 变化；然后再将上层黄色素溶液对准进光孔，看光谱又有何变化。把观察的结果用简单的图表示出来。5. H+和C

5、u2+对叶绿素分子中Mg2+的取代作用方法一：（1）取两支试管，第一支试管加叶绿体色素提取液2ml，作为对照。第二支试管中加叶绿体色素提取液5ml，再 加入5%HCl数滴，摇匀，观察溶液颜色变化。（2）当溶液变褐后，再加入少量醋酸铜粉末，微微加热，观察记载溶液颜色变化情况，并与对照试管相比较。 解释其颜色变化原因。方法二：另取醋酸-醋酸铜溶液20ml，以烧杯盛之。取新鲜植物叶片两片，放入烧杯中，用酒精灯慢慢加热，随时观察并 记录叶片颜色的变化，直至颜色不再变化为止。解释原因。五、注意事项1. 在低温下发生皂化反应的叶绿体色素溶液，易乳化而出现白絮状物，溶液浑浊，且不分层。可激烈摇匀，放在 3040C的水浴中加热，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。2. 分离色素用的圆形滤纸，在中心打的小圆孔，周围必须整齐，否则分离的色素不是一个同心圆。