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1、漆酶简介漆酶是一种含铜的多酚氧化酶(Laccase, P-diphenol oxidase, EC.1.10.3.2)，广 泛分布于高等动植物、昆虫、真菌分泌物和少量细菌中，其中最主要的是担子菌 亚门的白腐真菌。漆酶为含铜的糖蛋白，约由 500 个氨基酸组成，多为单一多肽，个别为四 聚体。糖配基占整个分子的10%45%，糖组成包括氨基己糖、葡萄糖、甘露 糖、半乳糖、岩藻糖和阿拉伯糖等。由于分子中糖基的差异，漆酶的分子量随来 源不同会有很大差异，甚至来源相同的漆酶分子量也会不同。通过对漆酶蛋白质 晶体结构的研究发现,漆酶具有3个铜离子结合位点,共结合4个铜离子,且这4个 铜离子处于漆酶的活性部位
2、,在催化氧化反应中起决定作用，如果除去铜离子,漆 酶将失去催化作用。漆酶具有较强的氧化还原能力，能催化多酚、多氨基苯等物质的氧化，使分 子氧直接还原成水，将酚类和芳胺类化合物还原成醌类物质，没有副产物的生成。 由于漆酶具有特殊的催化性能和广泛的作用底物，使得漆酶具有广泛的应用价 值。漆酶应用主要集中在制浆造纸，特别是纸浆的生物漂白，环境保护，木质纤 维素降解等方面。造纸工业方面，由于漆酶能高效的降解木质素及与木质素具有 相似结构的物质，避免造纸工序中所使用的化学物质影响环境。环境保护方面， 漆酶能有效的除去工业废水、化学农药当中的毒物酚、芳胺、单宁和酚醛化合物， 生物消除有毒化合物，使得漆酶在
3、废水处理等环保事业有广阔的前景。分光光度法测定漆酶活力最常用的底物是 2,2-连氮一双(3-乙基苯并唆毗 咯琳-6-磺酸)(ABTS)。实验一 高产漆酶菌株酶活测定1 主要试剂的配制（1） 0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液A液：0.2 mmol/L柠檬酸溶液：称取柠檬酸21.014 g,加入蒸馏水溶解定容 至 500mL。B液：0.2 mmol/L柠檬酸钠溶液：称取柠檬酸钠29.412 g,加入蒸馏水溶解 定容至 500mL。A液和B液混合，搅匀，于pH计上调节至pH4.5。（2） 0.5 mmol/L 的 ABTS 溶液将一片ABTS片剂（142 mg/片）用0.2
4、mmol/L pH 4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓 冲溶液溶解定容至250 mL,配成1.0308 mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的 ABTS母液，用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓冲溶液定容至100 mL。2 实验方法漆酶活性的测定方法： 从三角瓶中取出适量酶液，离心取上清得到粗酶液，放于样品管中。空 白管加入 1ml 液体的 PDA 培养基。 每支离心管中加入 5 倍的柠檬酸柠檬酸钠溶液稀释。 将样品管，空白管，0.5mmol/LABTS放在恒温水浴锅中，30C预热10min。 加入2mL预热好的酶液和0.5mmol/LABTS溶液达到3mL的反应液，于1cm
5、比色皿中，启动反应 5 分钟，测定 420nm 下吸光值随时间的变化值，每分钟读一 次数。在上述条件下，取吸光值变化的线性部分，定义每分钟转化 1umol 的底物所 需的酶量为一个酶活力单位，用U/mL表示。运用以下公式计算酶活。漆酶酶活力U/mL =AOD X V1x酶液稀释倍数At x V x s X 10 -62式中：s -ABTS 在 420nm 下吸光系数，为 3.6x 104M-1 cm-1 ；At lmin；AOD-lmin内，吸光度OD的变化值；Vl酶反应中，反应液的总体积， 3mL；V2酶反应中，酶液的体积， 2mL。实验二 高产漆酶菌株的酶学特性1 主要试剂的配制（1） 0
6、.2 mmol/L pH2.08.0 的柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液A液和B液混合，搅匀，于pH计上分别调节至pH2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、 7.0、 8.0。（2） 0.10.5 mmol/L 的 ABTS 溶液将一片ABTS片剂（142 mg/片）用0.2 mmol/L pH 4.5柠檬酸一柠檬酸钠缓 冲溶液溶解定容至250 mL,配成1.0308 mmol/L的ABTS母液；再取48.5mL的 ABTS 母液，用 0.2 mmol/L pH 4.5 柠檬酸柠檬酸钠缓冲溶液分别配制 l00 mL 的 0.1 mmol/L、 0.2 mmol/L、 0.3 mmol/L、 0.4 m
7、mol/L、 0.5 mmol/L 的 ABTS。2 方法2.1米氏常数（Km值）的测定在 pH3.5 的条件下，配制 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L、 0.5 mmol/L不同ABTS底物浓度，30 C反应，测定漆酶反应的初速度，求出二 者的倒数，以1/V对1/S作图，按照双倒数法（LineweaveBurk法）作图，得 到斜率为Km/V的直线，由此得到米氏常数Km值。2.2 漆酶的最适反应 pH 和 pH 稳定性测定将漆酶分别加入到pH 2.0pH 8.0缓冲液中，在30 C下，测定漆酶活性， 检测漆酶的最适反应pH。另外，将漆酶分别
8、加入pH 2.0pH 8.0缓冲液中，放 置1h后，在30 C，最适反应pH条件下，测定漆酶活性，以开始时漆酶活力为 对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的 pH 稳定性。2.3 漆酶的最适反应温度和热稳定性测定在漆酶最适反应pH条件下，分别在不同温度（20 C80 C）下，测定漆酶活性，得出漆酶的最适反应温度。将漆酶在 pH 3.5 环境中，分别在不同温度 （20 C80 C）下保温1 h,在最适反应温度、最适反应pH条件下测定漆酶活 性，以保温前漆酶活力为对照，计算漆酶的相对活力，得出漆酶的热稳定性。 2.4 表面活性剂对漆酶活性的影响将漆酶置于含有1 mmol/L表面活性剂（Tris、ED
9、TA、Tween80）, pH 8.0 缓冲液中，测定漆酶活性，以不添加表面活性剂漆酶活力为对照，计算漆酶的相 对活力，测定表面活性剂对漆酶活性的影响。实验三 漆酶的固定化一、实验原理壳聚糖是一种生物相溶性好、可生物降解、无毒易得的天然功能高分子材料，被广泛用来作为固定化酶的载体。壳聚糖分子中D 葡胺糖的-NH2可与双功能 试剂戊二醛的一个-CHO缩合，戊二醛的另一个-CHO与酶的游离氨基缩合，从 而壳聚糖戊二醛酶结构，即固定化酶。本实验采用以戊二醛为双功能试剂的 载体交联法固定化漆酶。二、材料、试剂和仪器1. 材料：壳聚糖，漆酶2. 试剂：1的冰醋酸溶液、甲醛（37）、 1mol/L NaO
10、H、 0.8的戊二醛（用磷酸缓冲液配制）、0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）、2 mol/L NaOH1%冰醋酸溶液；2mol/L 的 NaOH 溶液37%的甲醛溶液；0.1mol/L pH7.2 的磷酸缓冲液；0.8%的戊二醛溶液；的 NaCL）0.1mol/L pH7.5 的 PBS 磷酸缓冲液（内含 0.5mol/L 0.1mol/L 的磷酸缓冲液（pH7.2）： Na2HPO4 12H2O, 25.79g； NaH2PO412H2O, 4.37g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。 0.1mol/L 的 PBS 磷酸缓冲液（pH7.5）： Na2HPO412也0, 30.08
11、g； NaH2PO4 12H2O， 4.37g， NaCL， 29.22g 用蒸馏水溶解并定容至 1000ml。 0.8%的戊二醛溶液：将25%的戊二醛用磷酸缓冲液配制而成，现配现用。实验步骤1. 壳聚糖凝胶颗粒的制备称取0.5g壳聚糖充分溶解于35mLl%的冰醋酸溶液中，加入3mL甲醛 (37% )迅速混匀，在40C水浴中静置保温60min,得到透明的凝胶，加少量蒸 馏水将凝胶挤压破碎，倒出并在研钵中进一步破碎成适当大小的凝胶颗粒，接着 在烧杯中使其悬浮于lOOmL蒸馏水中，不断地用2 mol/L的NaOH将悬浮液的 pH值调至8.0，放置10min，然后用蒸馏水在抽滤漏斗上洗涤凝胶颗粒数次
12、，抽 去多余水分，备用。2. 壳聚糖凝胶颗粒的活化取上述凝胶颗粒10g，加入40mL 0.8%的戊二醛，室温放置60min，用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)洗涤凝胶颗粒34次，以除去多余的戊二醛，抽滤 备用。3. 酶的固定化向上述的凝胶颗粒中加入15mL漆酶酶液，4C下放置lh，中间搅动数次， 而后用0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 7.2)洗涤凝胶颗粒34次，以除去未固定的 酶，即得固定化酶。4. 酶活力的测定(1) 溶液酶活力的测定(2) 残留酶活力的测定(3) 固定化酶活力的测定四、数据处理及计算固定化酶总活力数活力回收()= X100%溶液酶总活力数固定化酶总活力数相对
13、活力()= X100%溶液酶总活力数残留酶活力数实验四 漆酶及固定化漆酶的应用一、漆酶对染料及果汁内酚类物质的降解溴甲酚绿二、染料最大吸收波长的确定将溴甲酚绿用 pH 4.5 的柠檬酸缓冲液溶解，于 UV2450 紫外可见分光光 度计在200 nm-800 nm范围内进行扫描，确定溴甲酚绿的最大吸收波长久max。三、染料脱色率的确定将溴甲酚绿用pH 4.5的柠檬酸缓冲液溶解，加入一定量的漆酶液，反应一 段时间后，于最大吸收波长处测定吸光值。按照以下公式计算染料的脱色率，比 较不同脱色条件对染料酶解的影响。AA染料脱色率R(%)= 0 i X100%0其中：A0为染料在最大吸收波长处的吸光值。A为反应体系加入漆酶以后在最大吸收波长处的吸光值。
