质谱测序及第三代测序

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1、第三代测序技术与质谱测序技术的介绍和比较质谱蛋白测序质谱分析是一种测量离子质荷比的分析方法。一级质谱主要是给出目标物的分子量， GC-MS一级谱图可以定性分析，LC-MS能用于简单的分子量测定。二级质谱可以看出目标 物的部分碎片，可以对目标物的结构进行分析。在蛋白测序方面，一级质谱结合肽质量指纹图谱(peptide mass fingerprint, PMF)可以初 步推测蛋白质的种类、序列。PMF基本原理是将蛋白质直接从双向电泳凝胶上切下或印迹 到PVDF膜上并切下，经过原位酶解得到酶解肽段，然后用质谱得到这些肽段的PMF,即 获得了肽质量指纹图谱。由于每种蛋白质氨基酸序列都不同，当蛋白质被

2、酶解后，产生的肽 片段序列也不同，其肽混合物质量数即具一定特征性。用实测的肽段质量去查找蛋白质和核 酸序列库，结合适当的计算机算法，可鉴定蛋白质。但这种方法不能用来直接测序，必须依 靠大量的数据库信息进行比对，准确率也受到限制。串联质谱可直接用于测定肽段的氨基酸序列，其过程是从一级质谱产生的肽段中选择母 离子，进入二级质谱，经惰性气体碰撞后肽段沿肽链断裂，由所得到的各肽段质量数差值推 定肽段序列。得到的质谱数据既可以通过仪器提供的软件解析，也可以进行手工解析。在第一级质谱得到肽的分子离子，选取目标肽的离子作为母离子，与惰性气体碰撞，使 肽链中的肽键断裂。主要有三种不同的肽键断裂方式，产生6中不

3、同的碎裂离子：即N端 的a, b, c型离子与C端的x, y, z型离子.每种断裂类型分别生成互补的两种离子，如 a-x,b-y,c-z。最常见的是a型离子、b型离子和y型离子，其他类型离子较少出现。将这些 碎片离子系列综合分析，可得出肽段的氨基酸序列。质谱法有不少优点，还能用于翻译后修 饰的分析(糖基化、磷酰化)，但目前只适用于20个氨基酸以下的肽段。此外，还存在固 有的局限性，比如Leu和lie、Lys和Gin不能区分，有些肽的固有序列不能用质谱法测定。R1ICIH a3-VM nil!OHCnihy2OHC R2C-I-H舄NIHR3CIH OHCH 4R4ICH第三代测序测序技术在近几

4、年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SNIRT和Oxford Nanopore Teclinologies纳米孔单分子测序技术，被称之为第三代测序技术。与前两代相比，他们最大 的特点就是单分子测序，测序过程无需进行PCR扩增。SMRT (single molecule Real-Time )测序技术该技术其实应用了二代测序边合成边测序的思想，并以SMRT芯片为测序载体。基本 原理是：DNA聚合酶和模板结合，4色荧光标记的4种碱基(即是dNTP),在碱基配对阶 段，不同碱基的加入，会发出不同光，根据光的波长与峰值可判断进入的碱基类型。具体的 反应在零级波导孔(zero-mode wavegu

5、ides, ZMW)的纳米结构中完成。这种ZMW是直径 50-100纳米，深度lOOmn的孔状纳米光电结构，通过微加工在二氧化硅基质的金属铝薄层 上形成微阵列，光线进入ZMW后会呈指数级衰减，从而使得孔内仅有靠近基质的部分被照 亮。中29DNA聚合酶被固定在ZMW的底部，模板和引物结合之后被加到酶上，再加入四 色荧光标记的 dNTP (A555-dATP, A568-dTTP, A647-dGTP. A660-dCTP) 当 DNA 合成进行时， 连接上的dNTP由于在ZMW底部停留的时间较长(约200ms),其荧光信号能够与本底噪音 区分开来，从而被识别。荧光基团被连接在dNTP的磷酸基团上

6、，因此在延伸下一个碱基时, 上一个dNTP的荧光基团被切除，从而保证了检测的连续性，提高了检测速度。SMRT的测 序原理如图所示。AB图A显示的是ZMW的结构，激光进入ZMW后呈指数级衰减，仅能照亮靠近底部的约30nm区 域，因此大部分游离的荧光标记dNTP不会被激发，只有结合到DNA聚合酶上的dNTP其荧光 基团被激光照亮，激发荧光。图B显示的是DNA合成过程中检测到的荧光信号及持续时间。结 合到酶上的dNTP停留时间较长，信号呈脉冲式激发，因而能够与噪音区分。另外，可以通过检测相邻两个碱基之间的测序时间，来检测一些碱基修饰情况，既如果 碱基存在修饰，则通过聚合酶时的速度会减慢，相邻两峰之间

7、的距离增大，可以通过这个来 之间检测甲基化等信息o SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP,但是，同时其测 序错误率比较高，达到15%。但好在它的出错是随机的，并不会像第二代测序技术那样存 在测序错误的偏向，因而可以通过多次测序来进行有效的纠错。纳米单分子测序技术与以往的测序技术皆不同，它是基于电信号而不是光信号的测序技术。该技术的关键之 一是，他们设计了一种特殊的纳米孔，孔内共价结合有分子接头。借助电泳驱动单个分子逐 一通过纳米孔，当DNA碱基通过纳米孔时，它们使电荷发生变化，从而短暂地影响流过纳 米孔的电流强度，而ATCG单个碱基的带电性质不一样，通过电信号的差异就能检测出通 过

8、的碱基类别，从而实现测序。纳米孔测序的主要特点是：读长很长，大约在几十kb,甚至100 kb;错误率目前介于1% 至4%,且是随机错误，通量很高，起始DNA在测序过程中不被破坏，以及样品制备简单 又便宜，理论上可以直接测序RNAo纳米孔单分子测序计算还有另一大特点，它能够直接 读取出甲基化的胞而不必像传统方法那样对基因组进行bisulfite处理。这对于在基因 组水平直接研究表观遗传相关现象有极大的帮助。但也面临DNA易位速率过快，电流变化 幅度较小，制备纳米孔材料的稳定性等问题。测序技术比较1、目的。两种方法都是为了进行测序。2、对象。都是生物细胞产物。三代测序对象是单细胞的DNA片段，不需

9、要PCR扩增，分 析单一的核昔酸种类；质谱测序对象是蛋白质的多肽片段，分析单一的氨基酸种类。3、结果。获得目的片段的序列。三代测序得到DNA或RNA序列，质谱测序得到多肽序列。 两者序列可以相互换算验证。4、原理。三代测序基于碱基互补配对原则，边合成边测序；质谱测序根据不同离子碎片荷 质比的差异进行区分。5、检测方法。三代测序利用荧光信号或电信号等检测，不同核昔酸对应不同信号，信号时 间的不同可以区分碱基的修饰类型；质谱测序通过荷质比数据计算分析，计算中有一些特定 的规律、公式，也有一些不可克服的误差因素。6、读长。三代测序读长很高，可以达到3000bp,测序速度约lObp/s；质谱测序只能针

10、对小 片段的多肽，在20个氨基酸左右。7、修饰。都可以检测发生的修饰。三代测序通过核昔酸合成的时间检测碱基修饰；质谱测 序通过荷质比分析氨基酸发生的修饰。8、精度。三代测序单次准确度约85%,重复测序可是准确率达到99.9999%：质谱测序准确 率较高，但有部分氨基酸不能通过荷质比进行区分。蛋白分析新技术超高分辨率显微技术自从1873年Ernst Abbe第一次发现光学成像具有衍射限制现象以来，物理学界就公认, 显微镜的分辨率具有极限，该极限与光源的波长有关。直到一个多世纪之后，罗马尼亚物理 学家Stefan Hell推翻了这一观点。他是首位不仅从理论上论证了，而且用实验证明了使用光 学显微镜

11、能达到纳米级分辨率的科学家。自从2006年STORM技术和PALM技术问世以来，科技工作者就一直在不断努力，对 它们进行改进、完善和提升。新技术比以往所有光学3D成像技术的分辨率都要高出10倍, 使以前很多看起来不可能的事情现在都变得可能了，对于蛋白质的分析研究有非常重要的意义。蛋白质芯片技术蛋白质芯片原理是对固相载体进行特殊的化学处理,再将己知的蛋白分子产物固定其上 （如酶、抗原、抗体、受体、配体、细胞因子等），根据这些生物分子的特性，捕获能与之 特异性结合的待测蛋白（存在于血清、血浆、淋巳、间质液、尿液、渗出液、细胞溶解液、 分泌液等），经洗涤、纯化，再进行确认和生化分析；它为获得重要生命信息（如未知蛋白 组分、序列。体内表达水平生物学功能、与其他分子的相互调控关系、药物筛选、药物靶位 的选择等）提供有力的技术支持。蛋白分离鉴定技术基于色谱技术的二维色谱（2D-LC）、二维毛细管电泳（2D-CE）、液相色谱一毛细管电泳 （LC-CE）等新型分离技木，基于质谱技术的质谱鸟枪法（Shot-gun）、毛细管电泳-质谱联用 （CE-MS）等新技术都可以在蛋白分离鉴定上发挥重要作用。