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1、摘要红曲的药用价值和保健功效日益引人关注，其中洛伐他汀作为红曲主要的调脂因子成为科研热点和红曲产业发展的重点。聚酮化合物Monacolin K是其中一种高效的降胆固醇药物，由红曲菌和土曲霉次级代谢产生，本实验研究红曲霉的代谢产物Monacolin K，通过对红曲霉次级代谢产物的测定，我们确定它产生Monacolin K最多的生长期，然后我们对其菌液进行RNA提取，通过对RNA的逆转录，我们得到cDNA，进行PCR扩增，验证Mokf和Mokh两段目的基因的存在，以及它们对红曲霉代谢产生Monacolin K的重要作用。对红曲菌功能基因组的深入研究，以及相应遗传转化体系的建立与完善，我们还需更加努
2、力。关键字：红曲 Monacolin K PCR RNA提取 红曲霉AbstractThe medicinal value and health care function of red rice is becoming more and more attractive to people, Lovastatin as red rice main lipid factor become research hot spot and focus of red rice industry development. Monacolin K, one of potent cholesterol-lowe
3、ring polyketide compounds, could be produced by Monascus spp and Aspergillus terreus. we experiment on Monacolin K which is one of monascus metabolites. According to the determination of monascus secondary metabolites，We determined the growing period when it produce Monacolin K fastest. Then we extr
4、act RNA on its microbial. Based on the reverse transcription of RNA, we obtain cDNA, then we amplify cDNA using PCR. We validate the existence of two aim genes Mokf and Mokh and their importance to monascus producing Monacolin K . With the further study on Monascus functional genomics, as well as th
5、e establishment and improvement of the corresponding genetic transformation system, we have to work harder.Key words：Monacolin K red rice PCR extract RNA monascus第一章 绪论71.1 红曲和红曲霉71.1.1 红曲和红曲霉的概述71.1.2红曲和红曲霉的发展前景71.2 红曲霉的生物学特征101.2.1红曲霉的分类101.2.2红曲霉的形态学特征101.3 红曲霉的代谢产物111.3.1 莫纳克林K111.3.2 红曲红素131.3.
6、3 桔霉素141.4红曲霉的培养141.4.1固态发酵141.4.2液态发酵151.5洛伐他汀（Monacolin k）151.5.1 他汀化合物的简述151.5.2 他汀类化合物的结构161.5.3 红曲洛伐他汀161.6 研究内容和意义17第二章 实验材料与方法182.1 实验材料182.1.1 实验所用菌种182.1.2 实验所用培养基182.1.3主要仪器和试剂药品182.2 实验方法202.2.1 菌种培养202.2.2 菌落观察及菌落生长情况及代谢产物测定212.2.3 DNA的提取及检测212.2.4 RNA的提取222.2.5逆转录RNA成cDNA（建立20ul反应体系）242
7、.2.6 PCR扩增逆转录得到的cDNA25第三章 实验结果与分析263.1 实验结果263.1.1 菌落形态观察263.1.2 菌种生长曲线273.1.3 莫纳克林K代谢情况273.1.4 红曲霉DNA Pcr扩增琼脂糖凝胶荧光观察（mokf和mokh）283.1.5 红曲霉种子液RNA提取结果293.2 实验结果分析293.3 注意事项303.3.1 培养菌中的相关事项303.3.2 提取RNA和DNA中的相关事项：30第四章 结论与展望314.1 结论314.2 展望32致谢34参考文献35附录.36文献翻译.39文献原文.52第一章 绪论1.1 红曲和红曲霉1.1.1 红曲和红曲霉的概
8、述红曲是以籼米为原料采用现代生物工程技术分离出的优质红曲霉菌(Monascus purpureus)经液体深层发酵而成，是一种纯天然、安全性高、有益于人体健康的食品添加剂。红曲生产历史悠久，是我国传统的发酵食品，也是现代社会应用广泛、药食同源的保健品。目前关于红曲定义的范围有所延伸，广义的红曲是指以红曲霉为菌种发酵(包括固态和液态发酵)淀粉质原料而制得的各种产品的总称。红曲霉以能产生大量红曲色素而得名，红曲霉(Monascus)中文别名 红曲、红糟、红大米，属于散囊菌目中的子囊菌曲霉科真菌，主要存在于树木、土壤中。红曲可用于酿酒、制醋、豆腐乳的着色剂和调味剂，也可做中药胡晓清. 红曲霉(Mon
9、ascus spp)莫呐可琳K(Monaco1inK)高产菌株的诱变选育及其发酵条件研究D.武汉：华中农业大学,2003.。红曲自古以来在我国一直用于食品的着色，特别是肉制品的着色。由于化学合成色素的毒副作用，研究者正致力于天然色素特别是生物色素的研究与开发孙艳君,胡中泽,高冰.红曲霉的分离鉴定及红曲色素的测定J.中国酿造，2011,1:52-54.，其中红曲霉生产的红曲色素得到了较为深入的研究用天然红曲色素代替合成色素用于食品、化妆品、药品的着色，已成为发展趋势。近年来，红曲在我国的应用有增无减。随着研究的不断深入，工艺的不断更新，市场上的红曲系列产品种类越来越多马美荣, 樊游等. 降胆固醇
10、红曲霉菌种的筛选J. 无锡轻工大学学报, 1999, 3:66-69.。红曲的产地多集中于我国福建、广东、浙江、台湾等地，福建省古田的红曲最为著名。如今，我国红曲产品的年生产能力不断提高，可达2万多吨，产值也达数亿元。目前应用范围较广泛的红曲产品是用于食品着色的红曲红，用于酿酒的红曲米及用于医疗保健的功能红曲等。国内代表产品主要有：红曲红色素、红曲米、“血脂康”、“脂必妥”等。1.1.2红曲和红曲霉的发展前景降低血脂及抑制胆固醇合成 血脂即为血浆中所含的脂类物质，其中包括胆固醇，胆固醇酯，甘油三酯及磷脂等。这些东西可以来自饮食，也可以由机体合成。体内合成的血脂约占血脂总量的70 %。李东，谢静
11、，王敏，等. 红曲起源新考J.中药材，2007，30(4):484-487.早在明代李时珍本草纲目对红曲作了较全面的记载，认为其“破血、活血”功效显著。经过现代人们的研究发现红曲霉的发酵产物之一莫纳克林K是天然他汀类物质，能有效降低血脂及抑制胆固醇的合成，具有综合调节血脂，实现“三降一升”，即降低胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白，升高高密度脂蛋白。清除血管垃圾，从而达到保护血管内皮，一级预防和二级预防各类心脑血管疾病，如脑中风、冠心病、高血压、心肌梗死等沈士秀. 红曲的研究、生产及应用J.食品工业科技，2001，22(1):85.。有数据显示，莫纳克林K在血液中的浓度只要达到0.001-0.00
12、5 g/mL，就可以使胆固醇的合成受阻。因此被广泛应用于药品、保健品中。目前，含有莫纳克林类物质的红曲己被开发成降血脂和治疗心血管等疾病的新药洪智勇,毛宁.红曲霉降胆固醇有效成分的研究J.海峡药学,2002,1. 32-34.。有关这方面的研究是当今红曲研究的热点之一，很多研究机构投入了很大的人力物力，希望能取得长足的进步。 降血糖作用红曲霉的培养物作饲料进行动物试验，发现试验兔在进食饲料后0.5 h内血糖降低了23%-33%，而在1h后血糖量仍比对照组下降了19%-29%鲁佳慧, 刘昕, 王江海, 等. 功能性红曲研究进展J. 2003 年全球华人保健 (功能) 食品科技大会论文集.。降血压
13、作用研究发现红曲还可作血压升高剂,对血压有双重控制作用。在饲料中添加红曲霉培养物的动物试验中,发现添加0.2%-0.3%的红曲霉培养物的饲料， 可使患先天性高血 压老鼠的血压由超过266KPa(200mmHg)降至24.0 KPa (180mmHg) 以下，其有效成分为c氨基丁酸(GABA) 和葡萄糖胺或红曲霉的其它细胞壁成分 。分别添加含有该生理活性物质的红曲米0.25%和0.35%， 用以制成180烤制的面包140高压瞬间加热的酱与不添加上述降压物质的普通面包和酱作对比试验，其降压效果明显 Chang L.，Yan Z.，Yin Y.W.，et al. Monascus purpureus
14、-fermented rice (red yeast rice)：A natural food Product that lowers blood cholesterol in animal models of hypercholesterolemia J.Nutrition Research，1998，18(l):71-81。红曲对自发高血压大鼠、DO-CA-盐型高血压大 鼠有明显的降血压作用 。每日经口服给予SHR大鼠、肾血管型高血压大鼠(RHR) 及DHR大 鼠0.0、0.4、0.8和1.2g/kgBW红 曲3 4 周 ， 每周测量收缩(SBP) 1 次.结果显示,红曲能够降低SHR 、
15、DO-CA-盐型高血压大鼠 (P0.05),对 R H R大鼠的降血压作用不明显,其中DO-CA-盐型高血压大鼠的降血压作用强于SHR。食品着色剂食用色素因其可以改善食品外观和色泽的功能，成为食品添加剂重要的组成部分。食用色素目前主要分为两大类：天然色素和合成色素崔莉红曲色素提取及其黄色组分制备与检测技术研究D泰安：山东农业大学，2008。随着人们对健康的关注，天然色素以其安全、绿色、无毒而备受青睐。天然色素主要是指从动植物材料和微生物细胞中获取的具有着色功能的产品。但是动植物材料生长繁殖受季节、气候、产地等多种因素影响，存在原料不足，产品价格昂贵等缺点，使应用受到限制，而利用微生物资源生产天然色素，可以有效避免这些缺点，而且工业化生产更为方便，因此，采用微生物生产天然色素将逐
