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1、生物化学实验实验一 糖的制备、定性及含量分析（4课时）一、 实验目的1. 学会糖的制备；2. 利用糖的呈色反应来粗略的定性糖类；3. 糖的含量测定4. 学会使用分光光度计。二、 实验原理还原糖溶于水，非还原糖被酸水解后一般也溶于水，故可用水提取。而原料中的蛋白质可用调PH值的方法除去或用沉淀剂，糖的进一步纯化可采用乙醇沉淀糖。糖的呈色反应有：Molisch反应、Fehling反应、Benedict反诉反应等多种呈色反应。可粗略的定性，较精确则是TCL（单糖，多糖需水解）、GC、HPLC、IR、UV、GC/HPLCMS来定性。本实验用Molisch反应粗略的定性。还原糖的测定是糖定量测定的基本方
2、法，对没有还原性的双糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有还原性的单糖进行测定，再分别求出样品中还原糖和总糖的含量（还原糖以葡萄糖含量计）。还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成正比关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，便可求出样品中还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。三、 实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料小麦面粉或罗望子；精密pH试纸。2 主要仪器（1）具塞玻璃刻度试
3、管：20mL11（2）大离心管：50mL2（3）烧杯：100mL1（4）三角瓶：100mL1（5）容量瓶：100mL3（6）刻度吸管：1mL1；2mL2；10mL1（7）恒温水浴锅（8）沸水浴（9）离心机（10）电子天平（11）分光光度计3 试剂（1）1mg/mL葡萄糖标准液准确称取80烘至恒重的分析纯葡萄糖100mg，置于小烧杯中，加少量蒸馏水溶解后，转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至100mL，混匀，4冰箱中保存备用。（2）3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂将6.3g DNS和262mL 2M NaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸
4、钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000mL，贮于棕色瓶中备用。（3）碘-碘化钾溶液：称取5g碘和10g碘化钾，溶于100mL蒸馏水中。（4）酚酞指示剂：称取0.1g酚酞，溶于250mL 70%乙醇中。（5）6M HCl和6M NaOH各100mL。（6）Molisch试剂：萘酚2g溶于95%乙醇并定容100ml，现配现用（7）冰醋酸、亚硫酸氢钠四、 操作步骤1罗望子多糖的制备工艺流程如下；2罗望子多糖的制备步骤 (1)原料的处理：先将罗望子种子外层红褐色的种皮用机械或化学方法除净，然后用粉碎机将白色的种仁粉碎至60一80目，得到白色的罗望于种仁粉。 (2)煮沸：取10g种仁粉，加入30倍的
5、清水，充分搅拌均匀(为了防止加水后种仁粉结团，可先加入少量水，先将种仁粉调成糊状，然后再加入剩余的水)，用冰醋酸溶液调节pH值，使水溶液的pH值控制在4256之间，搅拌加热至微拂，煮沸20一30min，得到一粘稠的浆状液。 (3)静置沉降；在浆状液中加入原体积50的热水稀释浆状液，搅拌均匀后静置沉淀812h，让浆状液中的蛋白质颗粒等杂质充分沉降。或用离心机离心5min,5000r. (4)分离过滤：将静置沉降后的上清液抽出，下层混思浆状液用离心或压滤的方法分离除去沉降物，合并上清液和滤液，得到乳白色浆液。 (5)浓缩：在乳白色浆液中加入少量NaOH稀溶液，将其PH值回调至中性，再加入少量亚硫酸
6、氢钠溶液漂白，然后加热浓缩至粘稠的半流体状时停止加热。 (6)烘干粉碎，将粘稠的半流体浆倒入白色浅瓷盘中，放入干燥箱中在70一80的温度下进行热风干燥，即得到片状罗望子多糖，最后用粉碎机将片状的罗望子多糖粉碎，即可得到灰白色的粉状罗望子多糖。3、糖的定量（1） 制作葡萄糖标准曲线取7支20mL具塞刻度试管编号，按表1分别加入浓度为1mg/mL的葡萄糖标准液、蒸馏水和3,5-二硝基水杨酸（DNS）试剂，配成不同葡萄糖含量的反应液。表1 葡萄糖标准曲线制作管 号1mg/mL葡萄糖标准液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）葡萄糖含量（mg）光密度值（OD540nm）0021.5010.21.81.5
7、0.220.41.61.50.430.61.41.50.640.81.21.50.851.01.01.51.061.20.81.51.2将各管摇匀，在沸水浴中准确加热5min，取出，冷却至室温，用蒸馏水定容至20mL，加塞后颠倒混匀，在分光光度计上进行比色。调波长540nm，用0号管调零点，测出16号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，葡萄糖含量（mg）为横坐标，在坐标纸上绘出标准曲线。（2） 样品中还原糖和总糖的测定A 还原糖的提取准确称取3.00g罗望子，放入100mL烧杯中，先用少量蒸馏水调成糊状，然后加入50mL蒸馏水，搅匀，置于50恒温水浴中保温20min，使还原糖浸出。将浸出液（含沉
8、淀）转移到50mL离心管中，于4 000r/min下离心5min，沉淀可用20mL蒸馏水洗一次，再离心，将二次离心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，混匀，作为还原糖待测液。B 总糖的水解和提取准确称取1.00g罗望子，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸馏水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加热水解30min（水解是否完全可用碘-碘化钾溶液检查）。待三角瓶中的水解液冷却后，加入1滴酚酞指示剂，用6mol/LNaOH中和至微红色，用蒸馏水定容在100mL容量瓶中，混匀。将定容后的水解液过滤，取滤液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混匀，作为总糖待测液。C 制备罗望子
9、多糖的含量测定取上述实验制备的罗望子多糖8mg，加入去离子水10ml。D 显色和比色取5支20mL具塞刻度试管，编号，按表2所示分别加入待测液和显色剂，空白调零可使用制作标准曲线的0号管。加热、定容和比色等其余操作与制作标准曲线相同。表2 样品还原糖测定管 号还原糖待测液（mL）总糖待测液（mL）多糖待测液（mL）蒸馏水（mL）DNS（mL）光密度值（OD540nm）查曲线葡萄糖量（mg）70.51.51.580.51.51.59111.510111.511111.512111.5 4、糖的鉴定Molisch反应：取（1）、（2）的提取液各1ml,加入2滴molisch试剂、摇匀。倾斜试管加1
10、ml浓硫酸，之后小心坚直。注意不要振摇。在糖溶液与浓硫酸两液间出现紫环，证明有糖的存在。为鉴定糖类最常用的颜色反应五、 结果与计算：计算出7、8号管光密度值的平均值和9、10管光密度值的平均值及11、12管光密度值的平均值，在标准曲线上分别查出相应的还原糖毫克数，按下式计算出样品中还原糖和总糖的百分含量。还原糖（%）=查曲线所得葡萄糖毫克数 提取液总体积测定时取用体积100样品毫克数总糖（%）=查曲线所得水解后还原糖毫克数稀释倍数0.9100样品毫克数罗望子多糖（%）=查曲线所得水解后还原糖毫克数稀释倍数0.9100样品毫克数六、附 注1 离心时对称位置的离心管必须配平。2 标准曲线制作与样品
11、测定应同时进行显色，并使用同一空白调零点和比色。3 面粉中还原糖含量较少，计算总糖时可将其合并入多糖一起考虑。七、思考题13,5-二硝基水杨酸比色法是如何对总糖进行测定的?2如何正确绘制和使用标准曲线?参考答案1植物中的总糖包括单糖、寡糖和多糖，单糖是还原糖，可直接测定。而没有还原性的寡糖和多糖，需用高浓度的酸在加热的条件下水解成有还原性的单糖，还原糖在碱性条件下加热被氧化成糖酸及其它产物，3,5-二硝基水杨酸则被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕红色物质颜色的深浅成一定比例关系，利用分光光度计，在540nm波长下测定光密度值，查对标准曲线并计算，可求出样品中
12、还原糖和总糖的含量。由于多糖水解为单糖时，每断裂一个糖苷键需要加入一分子水，所以在计算多糖含量时应乘以0.9。2标准曲线应在坐标纸上绘制，横坐标轴距坐标纸底边1.52cm，标示出刻度和葡萄糖的毫克数；纵坐标轴距坐标纸左边1.52cm，标示刻度和光密度值；曲线为过原点的直线，测定点均匀分布在直线的两侧；标准曲线只能在测试条件完全相同的情况下，用于确定样品中的物质含量。对于重复的测定，应取吸光度的平均值查标准曲线；测定数据不应记在标准曲线上。实验二 糖的硅胶G薄层层析（4课时）一、实验目的：1.理解薄层层析原理，2.掌握薄层层析技术，3.学会糖的较为精确的定性。二、实验原理：硅胶G是一种添加了粘合
13、剂的硅胶粉，约含12一13的石膏，它可以把一些物质从溶液中吸附于自身的表面上，利用它对各种物质的吸附能力不同，再用适当的溶剂系统展层，使不同的物质得以分开使用显色剂显色，得到不同的Rf值。糖在硅胶G薄层上的移动速度与糖的分子量和羟基数有关，经过适当的溶剂展开后，糖在薄层上的移动速度是戊糖己糖双糖三糖。三、实验材料、主要仪器和试剂1 实验材料硅胶G、多糖2主要仪器带密封盖的层析缸、硅胶G板、毛细管、100的烘箱、电吹风机、试管及试管架。3试剂（1）糖标准溶液：木糖、葡萄糖、果糖和蔗糖10mgm1水溶液。（2）样品液：多糖的水解液。（3）展开剂：乙酸乙酯：乙酸：水2：1：1；氯仿：甲醇60：40(
14、VV)。（4）显色剂：25一50硫酸；二苯胺1g，苯胺1ml和85磷酸5ml溶于50mI丙酮中。 四、操作步骤1将硅胶G板于l00烘箱活化后冷却至室温，用毛细管点样，点样位置为从硅胶板下端15cm、两侧23cm，每个样品点相距1一15cm，斑点直径2mm。点一次吹干一次。2将展层剂于层析缸中平衡。数分钟后，将硅胶板放入。3当展层剂移至距上端23cm时，取出硅胶板吹干，均匀喷上显色剂，于100显色。41530min后从烘箱取出，测量Rf值c五、结果与计算：六、思考 1薄层层折与其他层析法比较有哪些优点?实验三氨基酸的薄层层析分离和鉴定（4课时）一、实验目的1理解薄层层析原理，2掌握薄层层析技术，3学会氨基酸的较为精确的定性。二、实验原理薄层层析法是一种检验微量物质的快速准确的分析分离手段。它是将某种吸附剂在一块玻璃板（或硬质塑料板等）上铺成均匀的薄层，把要分离鉴定的样品溶液点在薄层板的一端，在密闭的层析缸内用适宜的溶剂（即展开剂）展开，从而进
