BMP2活性多肽体外定向诱导大鼠BMSCs 向成骨方向分化的实验研究

BMP2活性多肽体外定向诱导大鼠BMSCs 向成骨方向分化的实验研究 　　骨形成蛋白2（BMP2）具有较强的诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）向成骨方向定向分化的能力天然的BMP2数量有限，结构复杂，限制了其广泛应用本实验设计合成了BMP2活性多肽，体外试验探讨其对BMSCs向成骨方向定向诱导成骨分化的能力，评价BMP2活性多肽的诱导成骨效应［方法］实验分2组，诱导组和非诱导组取4周的Wistar大鼠分离培养BMSCs，传至第3代时，实验组，改用成骨诱导培养基（DMEM完全培养基+BMP2活性多肽200 μg／ml）非诱导组，仍采用DMEM完全培养基继续培养2~4周，采用细胞爬片培养、碱性磷酸酶活性和钙含量测定、实时定量PCR检测Ⅰ型胶原（ColⅠ）及骨桥蛋白（OPN）mRNA的表达，评价BMP2活性多肽的体外诱导成骨能力［结果］诱导组BMSCs生长良好，表现出与典型的成骨细胞相似的形态特征和生物学特性，ALP活性上升，钙含量增加，ColⅠ和OPN的mRNA呈高表达非诱导组，成骨特性不明显［结论］合成的BMP2活性多肽能有效地促进BMSCs向成骨方向分化，是组织工程化骨中理想的诱导成骨的细胞因子。

具有与天然BMP2类似的骨诱导活性，具有广阔的应用前景BMP2活性多肽 骨髓间充质干细胞 导成骨Abstract：［Objective］To investigate the capability of synthesis BMP2derived peptide on osteogenic induction in bone marrow stem cells(BMSEs),and to evaluate the osteoinductivity of BMP2derived peptide in vitro.［Method］After segregating and cultivating four weeks Wistar rats marrow stromal cells in induction group were induced by osteogenasis medium containing 200 gg/ml BMP2derived peptide,and in noninductional group BMSCs were still culture with DMEM medium.Following continue culture for 2~4 weeks,cells film preparation,alkaline phosphatase activity and calcium deposition were measured.Type I collagen（CoM）and osteopontin（OPN）mRNA expression were measured using realtime fluorescent quantitative polymerase chain reaction（FQPCR）technique.The capability of synthesis BMP2derived peptide on osteogenic induction of BMSCs was investigated.［Result］After inductived with BMP2derived peptide.BMSCs cultured survived well greatly changed in cell morphology,and showed a biological and morphologie characteristics similar to those of osteoblasts.The lever of alkaline phosphatase activity and calcium deposition increased.ColⅠand OPN mRNA were expressed at higher level.In noninductional group no conspicuous osteogenic induction was shown.［Conclusion］BMP2derived peptide can induce BMSCs to differentiate into osteoblasts.It has the similar capacity of osteogenic induction as nature BMP2,so BMP2derived peptide is an ideal cell agent for bone tissue engineering,and can be available widely.Key words:BMP2derived peptide;BMSCs;osteoinductivity骨髓基质细胞（bone mesenchymal stem cells，BMSCs）具有多向分化潜能，在一定细胞因子作用下可向成骨细胞方向分化，目前已成为骨组织工程理想的种子细胞〔1〕。

骨形态发生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMP）属于TGFβ超家族成员，是一种多功能的生长因子，其中BMP2是最主要的骨形成调控因子〔2、3〕天然BMP2数量有限，且生物活性难以发挥〔4、5〕本实验根据BMP2的核心功能区氨基酸序列，固相合成法合成一条含24个核苷酸的短肽——BMP2活性多肽，体外诱导大鼠的BMSCs向成骨方向定向分化，评价其诱导效能1材料与方法1.1主要仪器和试剂倒置相差显微镜（Axiovert35，Zeiss Corp，Germany）；低糖DMEM培养基（Cibco）；胎牛血清（Cibco）；胰蛋白酶（Sigma）；碱性磷酸酶（ALP）活性试剂盒（南京间建成生物工程有限公司）；细胞钙含量试剂盒（Sigma公司）；BMP2活性多肽（本课题组与吉尔生化上海有限公司联合研制）1.2BMSCs分离和培养取4周龄健康Wistar大白鼠2只，由同济医学院动物实验中心提供，体重约120 g，雌雄不限，10％水合氯醛腹腔注射麻醉，双侧下肢剪毛，75％酒精浸泡消毒30 min（将大白鼠头露于外面），无菌条件下取出双侧胫骨和股骨，剪除骨端，10号注射器抽取1 ml DMEM完全培养基（含20％小牛血清，100 mg／ml青霉素，100 mg／ml链霉素）自一端冲洗，制成单细胞悬液，以3×104／ml细胞数接种至100 ml培养瓶中，置于37 ℃、5％CO2及饱和湿度孵育箱中，24 h后全量换液，以后每3 d换液1次。

待细胞汇合成单层后，用0.25％胰蛋白酶进行1∶3消化传代1.3BMSCs的成骨诱导培养取体外扩增的第3传代细胞，以1×105个／cm2的种植密度接种到预置盖玻片的6孔培养板中传代培养将传代细胞分为2组，诱导组：培养24 h后，改用成骨培养基（DMEM完全培养基+BMP2活性多肽200 μg／ml）非诱导组：仍采用DMEM完全培养基2组细胞持续培养，常规3~4 d换液1次，进行细胞形态学观察及生物学特性检测1.4细胞内碱性磷酸酶（ALP）活性和钙含量检测成骨诱导培养基培养5、10、15及20 d时，将6孔板中的细胞用PBS洗2次，0.25%胰酶消化5～8 min，每孔加入培养基1 ml终止消化，4 ℃ 10 000r/min离心5 min，再用PBS洗3次，加细胞裂解液破膜按试剂盒进行ALP活性检测于520 nm波长处测定吸光度（A值）钙含量：培养皿用PBS洗2遍，加入1 ml 0.5mol/L HCl，振荡过夜，次日10 000r/min离心5 min，上清液用钙试剂盒（Sigma公司）测定钙含量每份上清液取20 L，以等量无离子水为空白对照，按试剂盒说明进行操作，于575 nm波长处测A值。

1.5实时荧光定量RTPCR检测ColⅠ和OPN mRNA的表达1.5.1引物设计在NCBI上搜索到大鼠ColⅠ和OPN基因，找到该基因的mRNA,结合使用Primer 5设计引物，由上海博亚生物技术有限公司合成引物ColⅠ引物序列：Forward primer：5′CAGACGGGAGTTTCTCCTCGGACGT3′；Reverse primer：5′GACCAGGAGGACCAGGAAGTCCACGT3′；OPN引物序列：Forward primer：5′TGGTTTGCCTTTGCCTGTTCG3′；Reverse primer：5′ATGGCTTTCATTGGAGTTGCTTG3′；βactin引物序列：Forward primer：5′AGCAGAGAATGGAAAGTCAAA3′，Reverse primer：5′ATGCTGCTTACATGTCTCGAT3′1.5.2大鼠BMSCs的接种处理及细胞收集将生长良好的第3代BMSCs以1×105个／cm2的密度接种预置盖玻片的6孔培养板中，BMP2活性多肽诱导组培养24 h后改用成骨诱导培养基。

非诱导组仍采用DMEM完全培养液；在第14 d时通过胰酶消化法收集细胞每组各取3孔FQPCR复测。