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1、实验一薄层层析板得制备一、实验目得制备薄层层析板，使叶绿素在层析板上分离显色。二、实验原理薄层层析,常用TLC（Chromatography）表示，又称薄层色谱,属于液固吸附色谱。就是近年来发展起来得一种微量、快速而简单得色谱法，它兼备了柱色谱与纸色谱得优点。一方面适用于小量样品（几到几十微克，甚至0、01卩g）得分离;另一方面若在制作薄层板时，把吸附层加厚，将样品点成一条线，则可分离多达500mg得样品。因此又可用来精制样品。故此法特别适用于挥发性较小或在较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析得物资。薄层吸附色谱得吸附剂最常用得就是氧化铝、硅胶、硅藻土、聚酰胺与纤维素.其颗粒大小，一般要求直
2、径为1040卩m硅胶就是无定形多孔性物质，略具酸性，适用于酸性物质得分离与分析。薄层色谱用得硅胶分为：“硅胶H”一不含粘合剂；“硅胶G”一含煅石膏粘合剂；“硅胶HF254”一含荧光物质，可用于波长为254nm紫外光下观察荧光；“硅胶GF254”一既含煅石膏又含荧光剂等类型。粘合剂除上述得煅石膏（半水合硫酸钙：2CaSO4H2O）外，还可用淀粉、羧甲基纤维素钠.三、实验材料、器具1、试剂硅胶、4%。得CMC溶液（羧甲基纤维素钠）2、实验用具：药匙、研钵、载玻片、量筒、玻棒四、实验步骤1、载玻片要求平滑清洁，没有划痕,在使用前可用洗涤液或肥皂水洗涤，再用水冲洗干净。（干净得标准：水不就是呈股流下，
3、而就是呈瀑布状态流下。）2、与硅胶混合：CMCNa溶液与硅胶得比例为3:1（3ml:1g）.取CMCNa溶液倒入研钵中，然后加入硅胶,在研钵中研磨,按一个方向研磨，自下而上，然后自上而下,以赶尽气泡为佳。3、铺板：将载玻片置于平台上，用药匙舀取糊状硅胶，均匀地铺在载玻片表面.铺板时，可以顺着板中间倒，也可以顺着某个边缘倒，也可以用玻璃棒引着溶液平铺在玻璃板上，倒时也要注意不要引入小气泡。尤其就是载板得四个角，容易高出玻璃板其她部位，所以要格外注意。后轻颠几下薄层板即可。颠好得板，表面瞧上去要光滑平整，没有气孔。薄层板铺好后一定要放置在平得台面上，否则难保证板面硅胶得厚度均匀（3g硅胶大约可铺7
4、、5X2.5cm载玻片5-6块）4?、晾干:置水平台上于室温下晾干.5?、活化:将晾干得板子在105C烘箱中干燥30min，然后取出，放入干燥器中，备用。活化硅胶有利于提高硅胶得吸附性能，同时排除硅胶内部已吸收得水分及其她气体.通过活化硅胶，主要改变了硅胶内部得微孔结构，使其孔径得大小及微孔结构得排列得到进一步得改善但就是这样硅胶得吸附变大，可能会使样品分离困难下面先介绍一下配置方法：1?、CMC-Na溶液得配置：一般其浓度为0、30、5%,根据自己经验而定（我习惯用0、4%得）。具体方法如下：先将预用得水加热至6070C，然后加入CMC-Na,边加边搅拌，使之溶解，即得。2?、与硅胶混合:C
5、MC-Na溶液与硅胶得比例为3:1。具体方法如下：先将CMC-Na溶液倒入自动搅拌器或研钵中，然后加入硅胶，搅匀即可。若就是在研钵中研磨，按一个方向研磨，自下而上，然后自上而下，以赶尽气泡为佳.3、铺板:手动或机械。手动铺出得板得薄厚与所加得混合后得硅胶量有关，而机械铺出得板得薄厚与机械所选用得钢板有关，可根据需要来定。但此过程中最关键得就是板子边缘铺得好坏，手动铺板一定要将玻璃板边缘硅胶涂匀（我习惯用两头掂法，即板下方得中间垫一物体，两头悬空，两手均匀掂动）而机械铺板要注意板与板之间平整性，或者由高到低排列。4、晾干：自然晾干。？5、活化:将晾干得板子在105C烘箱中干燥30min，取出，放
6、入干燥器中，备用。？这就是实验室与检验室薄层层析板常用得制备方法之一，供大家参考！层析英文名称:chromatography定义1:基于不同物质在流动相与固定相之间得分配系数不同而将混合组分分离得技术。当流动相（液体或气体）流经固定相（多孔得固体或覆盖在固体支持物上得液体）时，各组分沿固定相移动得速度不同而分离。能用于微量样品得分析与大量样品得纯化制备。定义2:利用某种类型得固定介质，根据混合物分子得电荷大小与分子量不同等性质，在流动相与固定相之间进行分离得一种生物化学技术。层析（chromatography）就是“色层分析得简称。利用各组分物理性质得不同,将多组分混合物进行分离及测定得方法。
7、有吸附层析、分配层析两种。一般用于有机化合物、金属离子、氨基酸等得分析。层析利用物质在固定相与流动相之间不同得分配比例，达到分离目得得技术。层析对生物大分子如蛋白质与核酸等复杂得有机物得混合物得分离分析有极高得分辨力在把微细分散得固体或就是附着于固体表面得液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合得）或气体作为移动相得系统中，使试料混合物中得各成分边保持向两相分布得平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲与力不同所引起得移动速度差，将它们彼此分离开得定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法根据移动相种类得不同，分为液体层析、气体层析二种。用作固定相得有矽胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤
8、维等，或就是在硅藻土与纤维素那样得无活性得载体上附着适当得液体，也可使用其她物质。将作为固定相得微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行得层析称为柱层析（columnchromatogra-phy），在玻璃板上涂上一层薄而均得物质作为固定相得称为薄层层析（thin-layerchromatography）,后者可与用滤纸作为固定相得纸上层析进行同样得分析，即在固定相得一端，点上微量试料，在密闭容器中，使移动相（液体）从此端渗入,移动接近另一端。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自得位置上，再根据Rf值得测定进行鉴定。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当得显色剂，或通过紫外灯下产生荧光得方法进行观
9、察。也可采用在第一种移动相展开后再用另一移动相进行展开（这时得展开方向应与原方向垂直）,使各成分分离完全得双相层析（twodimensionalchromatography）.分离后，将斑点位置得固定相切取下来，把其中含有来自试料得物质提取进行定量分析。但为制备与定量，柱层析则更为适宜。在柱层析中，移动相从加入试料得一端展开到达另一端后，继续展开使各成分与移动相一起向柱外分别溶出,这就就是广泛使用得所谓洗提层析（elutionchromatography）.层析根据固定相与溶质（试料）间亲与力得差异分为吸附型、分配型、离子交换型（离子交换层析）等三种类型。但这并不就是很严格得，有时常见到其中间
10、类型此外，近来也应用亲与层析，即将与基质类似得化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异得亲与性沉淀与其对应得特定得酶或蛋白质。按层析得机理划分：吸附层析、分配层析、离子交换层析、凝胶过滤层析、亲与层析等。吸附层析：利用吸附剂表面对不同组分吸附性能得差异，达到分离鉴定得目得。分配层析：利用不同组分在流动相与固定相之间得分配系数不同，使之分离。离子交换层析：利用不同组分对离子交换剂亲与力得不同凝胶层析：利用某些凝胶对于不同分子大小得组分阻滞作用得不同.按流动相与固定相得不同划分：气相层析、液相层析。这两大类层析就是以流动相不同来划分得如同时区分流动相与固定相，划分为：气固层析、气液层析、
11、液固层析与液液层析等.按操作形式划分：柱层析、纸层析、薄层层析、高效液相层析等。柱层析：将固定相装于柱内，使样品沿一个方向移动而达到分离。纸层析：用滤纸做液体得载体，点样后，用流动相展开，以达到分离鉴定得目得。薄层层析：将适当粒度得吸附剂铺成薄层，以纸层析类似得方法进行物质得分离与鉴定。以上划分无严格界限，有些名称相互交叉，如亲与层析应属于一种特殊得吸附层析，纸层析就是一种分配层析，柱层析可做各种层析。基本原理层析须在两相系统间进行一相就是固定相，需支持物，就是固体或液体。另一相为流动相，就是液体或气体。当流动相流经固定相时，被分离物质在两相间得分配，由平衡状态到失去平衡到又恢复平衡，即不断经
12、历吸附与解吸得过程随着流动相不断向前流动，被分离物质间出现向前移动得速率差异，由开始得单一区带逐渐分离出许多区带，这个过程叫展层。系数K就是物质在两相中得浓度比。K值大，则在固定相中吸附牢，K值小吸附差各物质间得K值差别大，则易被分离。不同类型层析得K值含义不同，可视为吸附平衡常数，分配常数或离子交换常数等。研究层析现象而发展得塔板理论，与有机化学实验中得分馏法原理有些相似。被分馏得有机溶剂在分馏柱内得填充物上形成许多热交换层，从而把低沸点溶剂先分馏出来，达到纯化得目得。在层析时用理论塔板数n来衡量层析效能。tR为物质在层析柱上得保留时间，W为洗脱下来得物质峰形得宽度。n值愈大表示层析柱得效能
13、愈高如用理论塔板高度H表示,则包含了层析柱长度得因子.式中L为层析柱得柱长。H值越大，则柱效越低.此外影响层析分离效果得还有涡流扩散、纵向扩散与传质阻抗等因素。因此选择层析固定相支持物得粒度、均匀度等物理性能，流动相得层析系统与温度等都就是做好层析得关键几种常用得层析吸附层析吸附剂得吸附力强弱，就是由能否有效地接受或供给电子，或提供与接受活泼氢来决定。被吸附物得化学结构如与吸附剂有相似得电子特性，吸附就更牢固.常用吸附剂得吸附力得强弱顺序为：活性炭、氧化铝、硅胶、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、石膏、纤维素、淀粉与糖等。以活性炭得吸附力最强。吸附剂在使用前须先用加热脱水等方法活化大多数吸附剂遇水即钝化
14、，因此吸附层析大多用于能溶于有机溶剂得有机化合物得分离，较少用于无机化合物洗脱溶剂得解析能力得强弱顺序就是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳与己烷等。为了能得到较好得分离效果，常用两种或数种不同强度得溶剂按一定比例混合，得到合适洗脱能力得溶剂系统，以获得最佳分离效果。分配层析在支持物上形成部分互溶得两相系统。一般就是水相与有机溶剂相。常用支持物就是硅胶、纤维素与淀粉等，这些亲水物质能储留相当量得水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配比率不同，展层时就会形成以不同速度向前移动得区带。离子交换层析支持物就是人工交联得带有能解离基团得有机高分子，如离子交换树脂、离子交换纤
15、维素、离子交换凝胶等。带阳离子基团得，如磺酸基（一S03H）、羧甲基（一CH2COOH与磷酸基等为阳离子交换剂。带阴离子基团得,如DEAE-（二乙基胺乙基）与QAE-（四级胺乙基）等为阴离子交换剂。离子交换层析只适用于能在水中解离得化合物，包括有机物与无机物对于蛋白质、核酸、氨基酸及核苷酸得分离分析有极好得分辨力。离子交换基团在水溶液中解离后，能吸引水中被分离物得离子，各种物质在离子交换剂上得离子浓度与周围溶液得离子浓度保持平衡状态，各种离子有不同得交换常数，K值愈高，被吸附愈牢。洗脱时，增加溶液得离子强度，如改变pH,增加盐浓度，离子被取代而解吸下来。洗脱过程中，按K值不同，分成不同得区带。
16、凝胶过滤层析支持物就是人工合成得交联高聚物，在水中膨胀后成为凝胶。凝胶内为内水层，凝胶周围得水为外水层。控制交联度以形成不同孔径得网状结构。交联度小得孔径大，交联度大得孔径小。凝胶只允许被分离物质中小于孔径得分子进入，大于孔径得分子被排斥在外水层，最先被洗脱下来。而进入孔径得分子也按分子量大小大致分离成不同得区带。选择不同规格得凝胶,可把一个混合物按分子量得差异分成不同得组分。这种方法曾被称为分子筛目前常用得凝胶商品有：葡聚糖凝胶(sephadex)、聚丙烯酰胺凝胶(bio-gel)、琼脂糖凝胶(sepharose)与聚苯乙烯凝胶(styragel)等。亲与层析在一对有专一得相互作用得物质中，把其中之一联结在支持物上，用于纯化相对得另一物质。常见得亲与对如：酶与抑制剂，抗原与抗体，激素与受体等。支持物为琼脂糖或纤维素等。气相层析属于分配层析或
