2012生工大实验GFP基因工程大肠杆菌的构建与发酵及GFP与单核昔酸离子交换层析研究摘要：含有pGLO质粒的基因工程菌株DH5a,在L-阿拉伯糖诱导后，表达绿色荧光蛋白经 5L发酵罐培养获得大量菌体破碎后细菌溶液经离子层析分离得到较纯的绿色荧光蛋白利 用离子交换树脂分离酵母菌制备的单核昔酸得到4种单核昔酸关键词：绿色荧光蛋白，发酵罐，离子交换层析，单核昔酸Construction and Fermentation of GFP Genetically Engineered E. coliand Separation of GFP and Single Nucleotide by Ion ExchangeChromatographyAbsti act: Plasmid pGLO can express green fluorescent protein in E. coli DH5 a when induced by L-arabinose. Fermentation in 5L fennenter got many biomasses. Tlie separation of fiagmented biomass by ion exchange cluomatography got pure gi een fluorescent protein. Tlie separation of mixed single nucleotide by ion exchange clu omatography got four kind of pure single nucleotide. Key words: green fluorescent protein; fermenter; ion exchange chromatography; single nucleotide1引言:绿色荧光蛋r I (Green fluorescent protein, GFP)是源于发光水母(Aequorea victoria )的一种蛋白质，英单 体分子帛:为27k Da,市238个氨基酸构成，是一个生物发光系统，这种蛋白质在体外经适当波长的光激发可发 出绿光，所发出的绿光用普通荧光显微镜或荧光激活细胞分拣器(FACS)均町检测到。
GFP作为动、植物以及 微生物基因工程研究上的一种广泛应用的选择标记具有检测灵敏度高，操作简便，对机体毒副作用小，不需 要添加任何底物或辅助因子，而且检测GFP无损于细胞或胚胎的完整性及活力等优点本实验拟利用重组DNA技术，构建转入外源GFP皋因的遗组大肠杆菌，并对基因工程菌培养条件进行 优化，在小型机械搅拌生物反应器进行发酵培养，并表达GFP0核苛酸的分离纯化采用离子交换层析法离子交换作用一般指在固相和液相之〔I 1生的可逆的离子交 换反应，它可用于分离各种可解离的物质通常离子交换剂是在一种高分子的不溶性母体上引入若干人最 功能基团这样人工合成的离子交换剂具有各种各样的性能2材料与方法见《生物工程专业人实验指导书》3结果3.1大肠杆菌基因工程菌株的构建利用感受态人肠杆菌构建基因工程菌成功率不高.因此处理后的大肠杆菌在不同成分的培养基匕会有 不同的生长状况未转化的人肠杆菌因没有导入质粒上的抗性基冈无法在含^Amp的培养基上生长大肠杆菌感受态细胞的转化及参照结果水+感受态大肠杆菌PGLO+感受态大肠杆菌LB平板培养基5000 个5000 个LB+^mp平板培养基99个5000 个LB^Amp+ara平板培养基776个1616 个注;其中LB平板培养基菌落过于密集无法计数按5000计，pGO+感受态大肠杆菌接种于LBMmp平板培养基涂布不均菌落部分密集按5000计.接种于LB^Amp^ra平板培养基均采用1/4平板计数法转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此表1中的菌落数可计算出转化子总数和转化频 率转化子总数=I箱落数X稀释倍数X转化反应原液总体枳""涂板菌液体枳902转化频率转化子总数转化子数每mg质粒DNA丿 质粒DNA加入最(mg)1840.44贡百= 920222.22= 1616x IX —= 1840.44#/82012生工大实验#/82012生工大实验感受态细胞总数=对照组2菌落数X稀释倍数x = -00 x：x^= 451000感受态细胞转化效率=转化子总数感受态细胞总数=0.408%#/82012生工大实验#/82012生工大实验3.2摇瓶发酵条件试验从正交试验结果中，我们町以得到本次实验的直观最佳条件，但这不一定是垠佳理论值。
我们可以根 据实验的最佳条件和理论最佳条件进行比较，在下一步试验中可以在这些水平范闱内，进行改变和加密水 平以求得更佳条件表2 L9(34)正交试验结果蛋白腺/%酵母粉/%体积/mL发酵时间/hNaCl/g接种*/mL稀释3倍后OD6oo 值10.80.4301203030.557#/82012生工大实验20.80.540140.40.40.02930.80.650160.50.50.875 141.00.440160.40.40.69451.00.550120.50.50.848 ]61.00.63014030.30.99971.20.450140.50.50.849 ]81.20.53016030.30.80391.20.640120.40.41.028 ]Ki0.7160.7000.786k20.8470.8260.861k30.8930.9670.857R0.1770.2670.075注:菌落呈现直径乳白色、0.5cm左右大小.表面湿润、中心突起的形态・第2组数据弃除.取第2、4、6、8. 9按OD600值从小到人重新编号为2、2、3、4、5,每组选25mL培养基离心弃去上清液, 烘干称重。
A -I 1 r-0.45 0.55 0.650.750.850.951.05 1.15bo二二5T」°°600图1不同ODg值下细胞干重质量含量3.3用重组大肠杆菌5升发酵罐试验将构造的工程菌接入5L发酵罐进行小批量发酵，间隔1小时取样测定•记录发酵状况 表3 10L发酵罐间隔1小时状况记录ODgoopHpH（试纸测）pO210.1066.2216.7020.273303006.21120.00 ■40.204632120.0050386638120.00 ■60.6706.2082.2070.9655.8063104.70 ■81.1815.556.0120.003/82012生工大实验91.4935.816.0100.00101.6636.016.0120.00111.7356.226.5120.00 .121.816.436.5120.00131.8716.616.5103.00 .141.9246.796.5111.20151.9626.906.5112.19 .161.9967.007.0117.70172.0347.077.0120.00 .182.0237.167.0118.00192.0517.277.2117.40注*第1组数据为工程菌未接种时发酵罐培养基状况，2组数据为接入工程菌后培养基的状况.两组测定间隔时间较短可以 忽路不计・发酵罐内培养基状态各种参数随时间变化趋势如F：图3 pH值随时间的变化趋势图3 pOz值随时间的变化趋势3.4 GFP离子交换层析分离在洗脱过程中先用Buffer A洗.没有荧光洗脱。
Buffer B梯度洗脱至17管的开始出峰但未见荧光至 20管时可见荧光，第22管时荧光最强3.5 RNA的制备和核昔酸的离子交换层析分离3.5.1酵母泥含水量及总交换容量的测定酵母泥含水量=湿酵母泥质量-干燥后酵母泥质量10 一 2.3910=76.1%#/82012生工大实验#/82012生工大实验树脂含水帛二W%G1-G2G1X 100% =29.99-29.022100% = 48.5%#/82012生工大实验静态法:总交换当屋E（亳克当鼠、 I克干树脂丿50 Nx - 2N2V2G(l-W)50 x 0.0976 -2 x 0.1 x 18.2251.2 x (1 - 48.5%)=1.9984#/82012生工大实验#/82012生工大实验动态法:二E（亳克当量、=标准HC1当量浓度X耗用标准HC1亳升数X倍数（体积比）=0.1 x 5.6 x丽 ， 令电I克干树脂丿- 树脂体积x湿真密度XW - 1.2 x 48.5%=2.11683.5.2核昔酸纯度及单核昔酸离子交换层析核廿酸纯度测定;#/82012生工大实验0.0260 x 10625 X 25/2.5 x 8/4 = 52pg/mLRNA含屋=(甲0D26o-乙OD260)/0.02 ( Mg/mL)样品浓度Sg/mL)(0.673 -0.326) /0.0252=33.4%#/82012生工大实验单核苛酸离子交换层析：离子交换树脂上样后，先后用0.02M甲酸、0.15M甲酸、0.01M甲酸+0.05M甲酸钠、0.1M甲酸+0.1M 甲酸钠洗脱€结果如下：图5 LP Data View软件软件导出图图上曲贱分别麦示AU值与电导率图6洗脱液OD”。
变化趋势从左到右分别为0.02M甲酸.0.15M甲酸、0.01M甲酸+0.05M甲酸钠、0.1M甲酸+0.1M甲酸钠洗脱峰#/82012生工大实验#/82012生工大实验将不同4钟溶液洗脱液分别合并9并测OD26O、OD25O' OD28O、OD290结果如下:#/82012生工大实验表4各洗脱液对不同波长光线吸收及比值0. 02M甲酸0.15M甲酸0.01M 甲酸+0. 05M 甲酸钠0. 1M 甲酸+0. 1M 甲酸钠0D2500. 0740. 1890. 1340. 172 ■0D2600. 1440. 2260. 1640. 174。