青蟹杂交种的分子鉴定研究摘要：种间杂交是提高青蟹养殖效益的重要环节，目前尚无鉴定青蟹杂交种的可靠 方法本文利用分子技术鉴定锯缘青蟹和拟穴青蟹两个种间的杂交种，旨在为青蟹的杂 交优势利用提供技术支持采用 PCR 扩增技术对锯缘青蟹与拟穴青蟹种间繁殖的 F1 代个体的 16SrRNA 和 COI 基因片段进行了扩增和测序，分别得到了长度为 532 和 628bp的片段通过统计变异位点、平均核苷酸差异数和核苷酸多样性指数，分析比 较子代中各体的序列差异，鉴定出了锯缘青蟹和拟穴青蟹的杂交种这些资料将为研发 青蟹优良品种提供新的依据关键词：锯缘青蟹；拟穴青蟹；杂交种；分子鉴定青蟹隶属于甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae),是一 种分布于印度-西太平洋沿岸的经济蟹类,在我国北起江苏连云港,南至海南岛均有分 布青蟹初期被认为只有 1 属 1 种, 不同的种名都属同物异名［1］后来， Estanpador［2］ 将其鉴定为 3 个种：S.serrata、S. tranquebarica、S. olivacea,其观点得到了 Serene^］ 的支持。
而Stephenson】4,5］认为青蟹属种群之间的差异尚未达到种间水平Radhekrishra 等［6］、Jeel等⑺将印度海域的青蟹定为2个种：S. serrata、S. tranquebarica可见该 属蟹类的分类一直存在争论目前的研究结果表明 ［8,9］,青蟹属内共有4个种:S.serrata(锯缘青蟹)、S. tranquebarica(紫螯青蟹)、S. paramamosain(拟穴青蟹)、S. olivacea(榄绿青蟹)，位于我国香港和厦门的青蟹为S.paramamosain(拟穴青蟹)近年 来,我国许多科研工作者致力于青蟹的繁育及人工养殖 ［10—14］,而对青蟹属的分类研究报 道不多,戴爱云等［15 ］只记载了青蟹属的一个种,即锯缘青蟹(S.serra ta)黎中宝等血］进 行了中国东南沿海锯缘青蟹(S.serra ta)群体的形态判别分析王玉江等卫］比较了中国 和越南青蟹(S. paramamosain)线粒体16S rRNA基因序列高天翔等级］对采自泰国，马 达加斯加，日本的3种青蟹进行了线粒体12SrRNA基因片段序列分析，认为分属3种不同 青蟹马凌波等［19］,高天翔等［2。
］分别分析了我国沿海不同地区青蟹的线粒体COI基因序 列和线粒体12S rRNA基因序列，结果显示不同地区青蟹都与S. paramamosain相似动 物线粒体DNA(mtDNA)具有分子量小、母性遗传及比核基因DNA进化速度快等特点，已被 广泛应用于进化生物学研究中［21,22］国外学者对 4 种青蟹 mtDNA 16S rRNA 和 COI 基因进 行了测序分析［9］［23］目前国内外对青蟹的研究大多是青蟹的分类，而对青蟹杂交种鉴定 方面研究甚少而本课题是在前者研究分类的基础上，利用现代分子技术鉴定青蟹杂交 种，为以后的研究提供理论依据和现实的参考1 材料与方法1.1 实验材料取锯缘青蟹(购自海南三亚水产市场，经鉴定符合品种要求)和拟穴青蟹(购自福 建厦门水产市场，经鉴定符合品种要求)各五十只，在适宜的条件下，抱对、孵化，直 至产生一定量的子代青蟹取子代的青蟹品种，实验待用1.2 实验方法1・2・1基因组DNA的提取与检测从子代青蟹群体中随机选8〜10个个体，每个个体取约100 g螯足肌肉，剪碎组织， 加入 475》L 组织匀浆缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH8.0;50 mmol/LEDTA,pH8.0),充分 混匀，依次加入终浓度为10%的SDS和20》g/mL的蛋白酶K,55°C裂解至澄清。
采用苯酚 -氯仿法提取基因组DNA［24］用DNA定量仪测定样品DNA的浓度和纯度,-20°C保存备用 1%琼脂糖凝胶电泳检测,GeneFinder染色,全自动凝胶成像系统拍照1.2.2 16sRNA和COI基因的PCR扩增16S rRNA基因片段扩增，引物见下表1PCR反应总体积为25》l,其中含模板DNA 50〜100 ng,10 X PCR buffer 2.5》L,上、下游 引物各 0.12》mol/L,dNTPs 0.2 mmol/L,MgCl22 mmol/L,Taq 酶 1 Un〕在热循环仪(Bio-Rad)上进行 PCR 反应：94C预变 性 2 min;94C变性 45 s,48C退火 1 min,72C延伸 1 min,35 个循环；72°C延伸 5 min表 1 所用引物序列Tab.1 Sequences of used primers引物序列16S AR5Z-CGCCTGTTTATCAAAAACAT-3/16S BR5Z-CCGGTCTGAACTCAGATCACG-3/C0IL14905Z-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3/C0IH21985-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3/1.2.3 DNA 序列测定扩增产物用 1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,将 PCR 产物纯化后直接进行双向测序。
1.2.4 序列分析将测得的全部序列用 Bioedit 软件进行编辑并辅以人工核查,用 Clustal X 1.83软 件比对，并确定序列长度用DnaSP 5.0软件计算群体的遗传多样性参数MEGA 4.0软 件计算序列的碱基组成、变异位点、简约信息位点、转换 /颠换以及不同群体间的Kimura2-paramter 遗传距离用于平均核苷酸差异比对的 GenBank 上2种蟹为:拟穴青 蟹、锯缘青蟹， 其外缘序列登录号及片段长度信息示于表 2表 2 外源序列物种名称， 来源和长度Table 2 Origin， length and abbreviations of sequences in foreign groups科/属/种Family/Genus/Species缩写Abbreviation登录号Locus片段长度 (bp) Lengthof Fragmet拟穴青蟹GenBank-AY841366(16S)511Portunidae/Scylla/S.paramamosnGenBank-EU664329(COI)522Scylla paramamosain锯缘青蟹GenBank-AF109318(16S)562Portunidae/Scylla/S.serrataGenBank-GU055502(COI)535Scylla serrat2 结果与分析2.1线粒体16S rRNA基因片段序列分析根据锯缘青蟹、拟穴青蟹以及实验所用的青蟹品种的16SrRNA基因序列比较结果， 对3个群体样品的线粒体16S rRNA基因片段进行PCR扩增和序列测定，得到长度为532bp 的基因片段。
将实验用子代青蟹与锯缘青蟹的16SrRNA基因序列相比较，共检测出4个 变异位点，其分别为：264位出现一个C-T转换、267位插入一个T、426位插入一个A、 420缺失一个C同理，将其与拟穴青蟹进行比较，共检测出2个变异位点，其分别为： 260位出现一个T-A颠换、415为插入一个T统计发现，实验用子代青蟹与拟穴青蟹、 锯缘青蟹的平均核苷酸差异数均为1.316，核苷酸多样性指数分别为0.005139、0.00375， 16SRNA的相似度分别为98.72%、99.24%显然，利用16S rRNA基因片段可发现实验青 蟹与亲本青蟹之间存在差异，但是由于 16SRNA 本生具有较大的保守性，所以其差异还 算较大经分析，不同群体的碱基含量基本一致，A、T、G、C含量平均为36%、34.7%、 17.8%、11.5%,A+T含量明显高于G+C含量，符合无脊椎动物线粒体DNA序列特征因此， 所选取的青蟹标本很可能为锯缘青蟹和拟穴青蟹的杂交青蟹品种，而且很有可能为一与 其亲本亲缘关系很近的新品种同时，16SRNA因为其具有很强的保守性，用作种间或种 内的分子基因分析结果差异不明显2.2 线粒体 COI 基因片段序列分析根据线粒体 COI 基因片段分析，在实验青蟹与锯缘青蟹和拟穴青蟹中共检测到 40 个变异位点，包括20个单一变异位点、 16个简约信息位点和4个插入/缺失位点。
共有 转换25个，颠换13个，转换/颠换为1.923基于COI片段计算的实验青蟹与其亲本的遗 传距离结果,可见杂交青蟹与亲本的遗传距离在0.168〜1.538之间COI基因DNA片段 相似度平均值为92.48%COI基因的差异性相较于16SRNA变异位点多而差异明显，适 用于青蟹的种间和种类的分子亲缘关系鉴定以及分析同时，将本实验结果与其他实验 的 COI 基因的结果比较，可推断出实验青蟹为杂交品种，且很有可能为一与锯缘青蟹和 拟穴青蟹亲缘关系相近的新品种3 结果讨论锯缘青蟹与拟穴青蟹都是我国现在青蟹的最主要的品种［26］本实验通过将其一起培 养，以研究它们的子代品种的青蟹是否为杂交品种，同时为青蟹的16RNA和COI基因分 析适合分子系统学研究提供依据根据研究结果分析，杂交青蟹线粒体COI基因和16S rRNA基因同源序列的分析表 明,AT碱基数量分数都明显高于GC碱基的数量分数,这与许多研究者在蟹类的线粒体基 因中观察到的结果相似[26,27,高AT数量分数是脊椎动物线粒体DNA序列中普遍存在的现 象由分析实验结果可知，COI基因比16SRNA基因具有更明显的差异性由于16SrRNA 基因较为保守，其变异较小。
但那相对于其他的比较，差异还是较大的COI基因的同 源序列碱基变化比较大,使编码的氨基酸发生改变其两种研究方法都适合分析系统学 研究，COI基因更适合于种内变异的分析，16SRNA更适合于种间亲缘关系的鉴定分析 可知实验品种的青蟹与两亲本之间有较大的的差异性，说明锯缘青蟹与拟穴青蟹可以杂 交此研究成果将有可能为青蟹新品种的培育和利用提供可靠地理论依据和技术支持参考文献：[1] Alcock A. Materials for a carcinological fauna of India, The Brachyuta of Cyclomatopa. Part 11. A revision of the Cyclometopa with an account of the families Portunidae, Canridae and Corystidae[J].Journal of the Asiatic Society of Bengal, 1899, 68(4):1-111.[2] Estampador E P.Studies on Scylla(Crustacea: Portunidae),1.Revision of the genus－ [J].Philippine Journal of Science,1949,78:95-108.[3] Serene R. Les especes du genere Scylla a Nhatrang (Vietnam)[R]. Proceeding of the Indo-Pacific Fish-ery Commission,1952,3:133-137.[4] Stephenson W, Campbell B. The Australian portunids (Crustacea: Portunidae) V. Remaining genera。