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1、第四章 柠檬酸教研室：生物工程 教师姓名：陆步诗、余有贵课程名称现代食品发酵技术授课专业及班次07级食品质量与安全方向授课内容柠檬酸授课方式及学时讲授、2H目的要求熟悉柠檬酸发酵生产的一般流程和技术要点。重点与难点1、柠檬酸发酵生产的一般流程和技术要点2、生产技术要点的理解讲授内容及时间分配 4.1生产流程4.2原料预处理4.3菌种4.4 发酵4.5 提取4.6 浓缩、结晶与干燥参考资料1、王福源.现代食品发酵技术（第二版）中国轻工业出版社.20072、宋东安.调味品发酵工艺学.化学工业出版社,2009教学过程4.1生产流程4.2原料预处理薯干经粉碎，以1620的比例在调浆罐中加水调浆，pH自
2、然5.5；添加0.1中温型-淀粉酶，0.070MPa液化1015min；过滤除渣；通过(NH4)2S04计量罐控制并调节培养基中含氮量为0.20.4；连续灭菌后，泵入已灭菌的发酵罐中，装料量为发酵罐体积的8590。4.3菌种及其扩大培养1、菌种 采用薯干原料进行液体深层通气发酵的菌株主要有黑曲霉Co827(上海工业微生物研究所选育)和黑曲霉T419(天津工业微生物研究所选育)，此二菌株具有糖化力高、产酸力强、发酵周期短、产物单一的特点，同时还具有营养要求低、耐高浓度柠檬酸、遗传性状稳定等优良性状，发酵6090h，产酸率可达1520，糖化率在97以上，已被大多数厂家采用。2、扩大培养根据黑曲霉在
3、实验室扩大培养阶段获得的是孢子还是菌丝体，其扩大培养分为孢子扩大培养和麸曲扩大培养2种方式。孢子扩大培养是利用液体或固体表面培养，收集黑曲霉孢子，再进行种子罐扩大培养或直接进行发酵盘液体浅层发酵生产柠檬酸；麸曲扩大培养是利用固体醅培养出黑曲霉菌丝体，再进行种子罐扩大培养或直接进行曲盘固体浅层发酵生产柠檬酸。目前，我国普遍采用麸曲扩大培养方式，其工艺流程如下：试管斜面固体菌种的表面培养250500mL茄子瓶固体表面培养10002000mL三角瓶麸曲固体表面培养种子罐液体菌种通气培养。 1)试管斜面固体菌种的表面培养 察氏琼脂培养基或麦芽汁琼脂培养基(10。Be/的无酒花麦汁，琼脂2)或米曲汁琼脂
4、培养基(1份米曲加4份水，55糖化34h，滤液用水调至10。Be/，用碱调pH6.O，加琼脂2)，加热溶化，分装试管，12130min灭菌后，摆放斜面，冷却后，以无菌操作接人已活化好的黑曲霉试管斜面菌种12白金耳或0.1mL孢子悬液，32培养45d，待长满茂盛的黑曲霉孢子即可使用。 2)250500mL茄子瓶固体表面培养 与试管斜面固体培养基相同，加热溶化，分装250500mL茄子瓶，每瓶45cm厚，12130min灭菌、冷却后，采用无菌操作，在试管斜面培养物中加入5mL无菌水，制成孢子悬液，将lmL孢子悬液接人茄子瓶固体培养基中，32培养67d，待长满茂盛的黑曲霉孢子即可使用。 3)1000
5、2000ml三角瓶麸曲固体表面培养 按麸皮(过60目筛)：水=l：(1.O1.3)比例混合后分装10002000mL三角瓶，每瓶50lOOg，12130min灭菌、冷却后，采用无菌操作，在250500mL茄子瓶固体培养物中加入无菌水，制成孢子悬液，将孢子悬液接入10002000mL三角瓶固体培养基中，进行麸曲固体表面培养。3032培养1416h后，菌丝长满曲料表面，翻曲1次，疏松结块；继续培养1d，翻曲2次；再培养34d，待长满孢子，制成麸曲即可使用。 4)种子罐液体菌种通气培养 薯干经粉碎，以1620的比例在调浆罐中加水调浆，pH自然5.5；添加0.1中温型-淀粉酶，0.070MPa液化10
6、15min；过滤除渣；泵入O.15MPa 15min灭菌的种子罐中，装料量为种子罐的70；通过(NH4)2S04计量罐向种子罐中添加0.5(NH4)2S044，以提高糖化力；搅拌均匀后，实罐0.1MPa 30 min灭菌，冷却至35；在种子罐中接入黑曲霉孢子或麸曲，接种量为孢子数104cfumL；培养温度控制在351；罐压维持2050kPa；通风量根据培养阶段而定(以10m3为例)：O6h，孢子吸水膨胀，通风量保持910 m3h；610h，为孢子萌发期，通风量保持18 m3h；10h，为菌丝体生长繁殖期，通风量增至3672 m3h。种子培养1828h，当培养液的pH降至2O2.5、滴定酸度为1
7、.52.0mL100g，而且菌丝球直径为24um(不超过100um)，菌丝球数目达到(12)104 cfumL时，种子培养结束。4.4 发酵待发酵罐中发酵培养基冷却至35时，利用无菌压缩空气将种子罐中的培养液泵人发酵罐，进行液体深层通气发酵。一般来说，发酵前期(018h)为菌丝生长和淀粉糖化阶段(当产酸量与还原糖的总量接近起始可发酵糖总量时，糖化阶段完成)；发酵中后期(1890h)为柠檬酸合成与积累阶段。 1)接种量的控制 在一定范围内，孢子接种量与产酸速率成正比。从理论上讲，菌球体的极限数量与接种孢子数量相等。由于孢子相互吸附以及孢子在发酵液中萌发时菌丝互相缠绕等物理作用，大多数菌丝球是由几
8、个孢子、乃至一团孢子形成的。孢子接种量越大，菌丝球直径越小、越多，产酸率越高。一般接种量为孢子数10104 cfumL。 2)发酵温度的控制 在黑曲霉液体深层发酵中，温度低于28，导致长菌和产酸缓慢；高于37，导致杂酸形成过量。一般来说，发酵前期(018h)，温度控制在3638，甚至可采用40高温培养，促进菌丝生长和淀粉糖化；发酵中后期(1890h)，温度降为351。 (3)发酵液pH值的控制 发酵前期(018h)，发酵液pH值控制在4.O4.5，促使淀粉糖化；发酵中后期(1890h)，发酵液pH值降至2.5左右，有利于柠檬酸的合成与积累。研究表明，在黑曲霉液体深层发酵中后期(1890h)的产
9、酸阶段，如果发酵液pH值在3.0以上，容易产生草酸；如果发酵液pH值升至5.0以上，则容易生成葡萄糖酸。另外，为防止发酵中后期(1890h)pH值下降过快而导致菌体早衰，一般在发酵2448h后，在发酵液中添加(510)gL的碳酸钙，以维持发酵产酸阶段正常的pH值水平。 (4)通风供氧和搅拌的控制 柠檬酸发酵是典型好氧发酵，对氧十分敏感。黑曲霉生长期溶氧分压不得低于1.8kPa，产酸期溶氧分压不得低于3.2kPa。当发酵进入产酸期时，在一定范围内，产酸速率几乎与溶氧分压成正比，溶氧分压下降到10kPa时，产酸速率下降不大；溶氧分压下降到3.2kPa时，产酸能力基本丧失；溶氧分压下降到1.8kPa
10、(临界溶氧分压)以下时，产酸能力完全丧失，而且低溶氧下产酸能力的丧失，很少能重新恢复。通过通风量的控制，使产酸速率保持在(23)g(h.L)的水平，如果产酸速率过快，则造成菌体早衰，柠檬酸的最终产量下降。对于50m3发酵罐而言，发酵前期(018h)，通风量控制在O080.1vvm；发酵中后期(1890h)，通风量控制在0.12O.15vvm。50m3箭叶涡轮搅拌桨式发酵罐的搅拌速率控制在90110rmin，100m3自吸式桨叶低搅拌式发酵罐的搅拌速率控制在135rmin。整个发酵期间罐压保持O.1MPa。 (5)发酵终点控制 以薯干粉为原料，黑曲霉液体深层通气发酵至6090h，当发酵液中总糖含
11、量自140160gL降至残糖含量为2gL以下、产生的柠檬酸浓度达到120155gL、糖的转化率达到9397时，可升温终止发酵，泵送至贮罐中，及时进行提取。4.5 提取柠檬酸提取的方法有钙盐法、萃取法、离子交换法、电渗析法等。但目前国内大多采用钙盐一离子交换法，其工艺流程为：发酵醪的预处理过滤中和沉淀酸解净化脱色。 1)发酵醪的预处理 新鲜成熟发酵醪升温至7590，温度不宜过高，加热时间不宜过长。其原理是杀死柠檬酸生产菌和杂菌，终止发酵，并防止柠檬酸被代谢分解；使蛋白质变性，絮凝和破坏胶体，降低料液黏度，利于过滤；使菌体中的柠檬酸部分释放。加热温度过高或时间过长，会使菌体破裂自溶，释放出蛋白质，
12、使料液黏度增加、颜色变褐，不利于净化。 2)过滤 过滤目的是去除发酵醪中的悬浮物、草酸，尽可能减少滤液的稀释度，把柠檬酸的损失减少到最低限度。其原理是用一种多毛细孔的过滤介质，利用过滤介质两侧的压力差为推动力，使柠檬酸发酵醪的液体通过小孔，得到澄清的滤液，而菌体、纤维等残渣悬浮物被截留、积累在介质表面形成滤饼。过滤效果取决于滤饼的厚度和特性，滤饼达到一定厚度时，才变成真正的过滤介质，为此，开始过滤时流速不宜过大，否则细小颗粒宜穿过介质空隙而未被截留，只有当介质表面积有滤饼时，滤液才变清；由于草酸钙溶解度低于硫酸钙，在一次滤液中加硫酸钙，使生成草酸钙，在复滤时再一并除去。 过滤液质量主要参数：一
13、次滤液柠檬酸(一水)9.Og100mL，悬浮物O.1g100mL；滤饼含水量5570，柠檬酸(一水)2.5；复滤液柠檬酸(一水)9.0g100mL，悬浮液5mgL，草酸为0。 3)中和沉淀 过滤获得了去除菌体、残渣和草酸的澄清柠檬酸液，其中除主要含有柠檬酸外，还含有可溶于水的碳水化合物、胶体、有机杂酸、蛋白质等杂质。 根据在一定温度和pH条件下柠檬酸钙在水中的溶解度极小的特性，采用钙盐或钙碱与溶液中的柠檬酸发生中和反应，生成四水柠檬酸钙Ca3(C6H5O7)2.4H2O从溶液中沉淀析出，除去残液后，用8090热水洗涤四水柠檬酸钙沉淀，可最大限度地将可溶性杂质与柠檬酸钙分离，其反应式为： 2 C
14、6H8O7. H2O +3 CaC03 = Ca3(C6H5O7)2.4H2O +3CO2+H20 2 C6H8O7. H2O +3Ca(OH)2 = Ca3(C6H5O7)2.4H2O +H20 中和技术参数: 每千克柠檬酸加石膏量O.03O.15kg，中和剂(CaC03.CaO)浆乳中固型物含量22，中和剂含MgO1.5，盐酸不溶物1.01，Fe203+A12031.0。 中和起始温度7075，中和最终温度8590。 中和最终pH4.44.6(CaC03)、4.85.2Ca(OH)2。 洗涤柠檬酸钙水温8590，洗水量(与钙比)：采用带式过滤机为3.O3.5倍；采用抽滤为4.55.0倍。
15、过滤真空度O.0250.028MPa。 柠檬酸钙和废水的质量要求：柠檬酸钙含固型物40，易碳化合物(Readily Carbonizable substances，RCS)0.02(以糖计)，废水中柠檬酸钙含量300mgL。 4)酸解 利用柠檬酸钙在酸性条件下，其解离常数随H+浓度的增高而增大的特性，在强酸(硫酸)存在的溶液中产生复分解反应，生成难溶于水的石膏(CaS04)沉淀，而将弱酸(柠檬酸)游离出来。工业生产中，控制酸解温度为6070下，CaS04.2H20的溶解度低于Ca3(C6H5O7)2.4H2O的溶解度的原理，加H2S04产生复分解反应，将柠檬酸从柠檬酸钙中分离出来，然后过滤除去硫酸钙(石膏)，获得粗柠檬酸液(酸解液)。其反应如下： Ca3(C6H5O7)2.4H2O+3 H2S04+4H20= 2
