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1、本科生毕业论文（设计）开题报告书题 目拟兰芥染色体的核型分析学生姓名侯小龙学 号 09190104专业班级芙蓉生科0901指导老师席在星2012 年 10 月 1 日 论文（设计）题目 拟兰芥染色体的核型分析课题目的、意义及相关研究动态：目的：能熟练运用低渗法制备拟兰芥染色体标本，得到质量优秀的玻片，并能运用显微摄 影技术对其拍照，在核型分析系统对其进行核型分析，得到其核型公式。熟练掌握常见的 染色体纸片实验技术，包括低渗、固定、染色、显微摄影等。意义：确定拟南芥的核型，摸索出一条，以组织培养技术培养出愈伤组织，从而获得大量处于分裂期的 细胞。通过对愈伤组织的细胞进行同步化处理（固定），获得大
2、量的处于分裂中期的，从而获得优质的原 材料。再通过对这些材料进行预处理，低渗，固定，解离，染色，显微摄影，最后通过专门的核型分析软 件Karyo3.0染色体核型分析系统研究动态：拟南芥-植物组织培养十字花科,二年生草本，咼740厘米。基生叶有柄呈莲 座状，叶片倒卵形或匙形；茎生叶无柄，披针形或线形。总状花序顶生，花瓣片，白色， 匙形。长角果线形，长11.5厘米。花期35月。 我国内蒙、新疆、陕西、甘肃、西 藏、山东、江苏、安徽、湖北、四川、云南等省区均有发现。拟南芥的基因组是目前已知植物基因组中最小的。每个单倍染色体组（n=5）的总长只有7000万个碱基对，即 只有小麦染色体组长的1/80，这
3、就使克隆它的有关基因相对说来比较容易。拟南芥是自花受粉植物，基因高度纯合，用理化因素处理突变率很高，容易获得各种代谢功能的 缺陷型。例如用含杀草剂的培养基来筛选，一般获得抗杀草剂的突变率是1/100000。由于 有上述这些优点，所以拟南芥是进行遗传学研究的好材料，被科学家誉为“植物中的果蝇” 广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学的研究，已成为一种典型的模式植物，其 原因主要基于这种植物具有以下特点：1、形态个体小，高度只有3O-40cm左右；2、生长周期快，从播种到收获种子一般只需6周左右；3、种子多，每株每代可产生数千粒种子；4、形态特征简单；5、基因组小，只有5对染色体。虽然这种植物
4、在许多方面简单”，但它的大多数基因与其他，复杂的植物基因具有很 高的同源性，另外，由于这种植物的全部基因组测序已于2000年完成，通过测序获得的拟 南芥基因组核苷酸序列全部公布在互联网上，有力地推动了植物生命科学研究向前发展。 因此可以预测，拟南芥在植物学所有领域的研究中将发挥更大的作用。我们通过对拟南芥 研究所获得的信息将有助于人类对控制不同植物复杂生命活动机制的认识。课题的主要内容（观点）、创新之处：染色体制片是指显示染色体形态和结构的技术，目前常用的技术有两种，即压片技术和去 壁低渗火焰干燥技术。前者操作简便，但在处理某些细胞壁较硬和难以软化的材料时，不易获 得良好的压片;后者虽然制片效
5、果较好,但操作过程需要严格控制实。而组织培养技术培养出 愈伤组织，从而获得大量处于分裂期的细胞。避免了因为采集种子的时间错失，或者种子 的量不多的情况下，就可以用植物的别的器官代替，如果经过脱分化处理。可以获得大量 处于细胞期分裂能力强的细胞，就可以避免尤其是新手对于取材不到位的麻烦。凡是细胞处于活跃增殖状态或经过某种实验处理后进入细胞分裂状态的任何植物组 织，如植物根尖、茎尖、幼叶、花蕾、幼花粉、幼胚、核型胚乳、愈伤组织、居间分生组 织、茎形成层等细胞分裂状态的植物组织均可以作为染色体分析的实验材料；通过8-羟基 喹啉、秋水仙素、对二氯苯等预处理药剂处理，来降低细胞质的粘度，促进染色体缩短分
6、 散，障碍纺锤体形成；通过纤维素酶、果胶酶酶解去壁，使分生细胞的原生质体能从细胞 壁里压出来，经过精心制片，使染色体周围不带有细胞质或仅有少量的细胞质，获得图象 清晰、完整、高度分散的染色体典型图象。各植物种的染色体数目都是恒定的，二倍体植物体细胞内都含有两组相同的染色体 （chromosome），每一条染色体都有两条染色单体（chromatids）。细胞有丝分裂时，每一条 染色单体分向细胞两极，形成子细胞；细胞分裂间期染色单体复制，纵裂并向的两条染色 单体往往通过着丝粒（cen tromere ）联在一起。着丝粒在染色体上的位置是固定的，呈现 出一个淡染色区间。着丝粒的两端是染色体的“两臂”
7、，着丝粒不在中央的染色体，就必然 有长臂（q）、短臂（p）之分。由于着丝粒位置不同，可以把染色体分成中部着丝粒染色体 （m）、近中部着丝粒染色体（sm）、近端部着丝粒染色体（st）及端部着丝粒染色体（t）。 有些染色体除了着丝粒之外，还有一段稍窄的淡染色区，叫次缢痕；次缢痕的远端突起， 为随体（satellite）。所谓核型（karyotype）就是指：一个细胞内的染色体按照一定的顺序排列起来，所构 成的染色体图象；通常是将显微摄影得到的染色体照片粘贴或染色体核型分析系统软件处 理生成的染色体图象。所谓组型（idiogram）就是指：通过许多细胞染色体测量，取其平 均值绘制成的染色体模式图；通
8、常是用染色体相对长度（relative length）、臂指数（am index）、着丝粒指数（centromere index）等形态特征参数来描述染色体模式图。人类染 色体研究早在I960年就召开了专门的国际会议，确定了人类染色体核型分析的国际标准， 即Denver命名标准；但植物染色体核型分析至今还没有一个专门的国际标准；1984年8月， 我国第一次全国植物染色体学术讨论会上，李懋学、陈瑞阳（1984）所作的“关于植物核 型分析的标准化问题”报告，经过与会代表的充分讨论，成为大家的约定标准，被同行所 承认。由于染色体是基因的载体，核型代表了种属的特征，所以染色体组型分析对于探讨 植物生命
9、奥秘、生物起源、物种间亲缘关系、远缘杂种鉴定等方面都有重要意义。研究方法、设计方案或论文撰写提纲：一：实验准备1、设备：普通生物显微镜、NIKON数码摄影显微镜、NIKON数码相机、计算机图象处 理系统、培养箱、恒温水浴锅、喷墨彩色打印机等；2、用具：载玻片、盖玻片、眼科镊子、不锈钢剪刀、单面刀片、磨口三角瓶、移液管、试 剂瓶、凹型孔白瓷板、玻璃板、烧杯、天平、电炉、染色缸、扩大镜、游标卡尺、滤纸片、 玻片标签纸等；3、药品：8羟基喹啉、秋水仙素、氯化钾、甲醇、冰乙酸、纤维素酶、果胶酶、对二氯 苯、氯化钠、柠檬酸钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氢氧化钡、甘油、盐酸、胰蛋白酶、 尿素、氯化钙、EDT
10、A、Giemsa、洋红、地衣红、卡宝品红、锡夫（Schiff）试剂，MS培 养基，IAA , 6-BA。二：试验方法：（一）:拟南芥-植物组织培养材料与方法1 实验材料 将拟南芥种子经10%双氧水消毒后接种于MS培养基上，于 28度、光照1Oh培养五周，长出无菌苗。在无菌条件下切取叶片和茎段，接种于MS诱导 培养基上。于白天28C（附加光照12h）、夜间2OC温箱中培养，长出愈伤组织后转移至 分化培养基上。培养基基本培养基为MS，其中诱导培养基附加植物激素IAA. 2-5 mg，分化培养基附 加6-BA. 1-5mg，IAA. 5mg；蔗糖2Og，琼脂1. 2%，pH5. 8。 愈伤组织的诱导
11、和试 管苗的分化在诱导培养基上培养1周，叶段和茎段的切口处开始膨大，两周后愈伤组织生 长良好，表面呈粒状，局部变绿。在一些外植体上长出根系，在带芽的茎段上直接长出小 苗。将愈伤组织切下转入分化培养基上，五周后就有芽和根分化，两周后小苗生长正常。将完整的试管苗取下转入新培养基上，1周后从苗基部生长出次生苗。在原培养基上生长 23周后，将试管苗移入土壤可成活。实验表明，拟南芥也是一种组织培养的示范材料，这主要基于以下事实：易获得无菌苗。种子经表面消毒后接种于培养基上，五周后就可得到足够大且健壮的无菌 苗，在无菌条件下切断并接种，几乎不会发生污染。相反，若对外植体进行表面消毒对初 学者来说是较困难的
12、，消毒时间长会导致外植体被杀死”，而时间短又达不到完全消毒， 且消毒剂的残留也会影响外植体的生长。另外，由于外植体的表面消毒步骤较多，很容易 引起再污染，因此我们认为对初学者来说易于获得无菌苗是十分重要的。（2）愈伤组织的诱导和试管苗分化周期较短。，从愈伤组织诱导到完整植株再生大概1 个月。植株分化率高，几乎所有的外植体都能诱导分化出苗。试管苗的繁殖速度快。将单一的试管苗分割后转入新的培养基上，1周后从其基部长出次 生苗，长到一定大小后又产生新的次生苗，这样，2O多天后就可可由一株试管苗产生出 100多株。诱导与分化所需条件简单。诱导培养基中只加IAA,且在一定浓度范围内均有效，分化所 需激素
13、也较简单。（二）：染色体装片的制备：1、取材将上一获取的遇上组织从培养基中取出，并用无菌水，毛笔轻轻刷洗，直至洗去粘附在遇 上组织上的培养基为止。2、预处理目的及作用：植物有丝分裂中期染色体高度浓缩，形态和结构都比较清楚，但因纺垂体 的作用，染色体紧密地排列在赤道板上，很难将其分开，尤其是染色体数目较多的植物材料， 很容易产生染色体严重重叠；而且因细胞分裂中期维持的时间短，一般仅10-30min,使中 期染色体细胞出现频率不高。为了克服上述矛盾，常用化学或物理方法对材料进行预处理。 这些方法的作用机理及其作用是：阻止或破坏纺垂体微管的形成，由于没有纺垂体的作 用，细胞有丝分裂过程，被阻抑在细胞
14、分裂中期阶段，从而累计比较多的处于细胞分裂中 期的染色体图象。促进染色体浓缩变短，减少染色体之间相互缠绕重叠，有利染色体的 高度分散。改变胞质粘度，促进染色体清晰，促进细胞质清洁。所以预处理是否适宜， 是染色体制片技术中最关键的操作步骤；如果预处理的效果良好，即使是初学者也不难制 作出优良的染色体标本，反之，如果预处理失败，即使是很有经验的人也难以制作出好的 制片。处理药剂可以用作染色体预处理的化学药品，主要有生物碱、貳类、酸类及其他物质；最常用的化 学药品有秋水仙素、8羟基喹啉及对二氯苯。 秋水仙素(Colchicine)：是从石蒜科秋水仙素属秋水仙(Colchicum autumnale)
15、种子或鳞茎 中提取的一种生物碱，其分子式为C22H25NO6+1.5H2O,分子量为399.45。纯秋水仙素为 针状结晶，商品多为白色或淡黄色粉末融点155C，易溶于水、酒精、氯仿及甲醛中但在 热水中的溶解度差，不溶于苯。剧毒易引起眼睛失明或中枢神径麻醉，使用时一定要要注 意安全。秋水仙素预处理的有效浓度为0.001-1%，常用浓度为0.05-0.2%。 8羟基喹啉(8-hydroxyquinoline)：白色结晶或粉末，其分子式为HO8H3N： CHCH： CH,分子量145.17。溶于酒精，难溶于水，需60C、2 3h才完全溶解。8羟基喹啉不仅 具有秋水仙素的预处理的效果，而且所显示的染色
16、体缢痕及随体的结构，往往比秋水仙素 更为清晰，尤其在处理中、小型染色体比秋水仙素好，能使染色体、缢痕及随体的图象更 清晰。常用浓度为0.002mol/L，少数学者使用0.004mol/L浓度，但使用者不多。处理方法预处理的方法往往容易被忽视，但预处理失败的实验多是预处理的方法使用不当而致。就 材料本身而言，预处理的方法有离体处理、非离体处理和低温三种。 离体处理：即将处理器官或组织从母体上切除下来，浸没在预处理液中。该处理方法的 主要特点是药物作用迅速，短时简便，良好的预处理效果是在细胞的某些合成作用受到抑 制，而前期分裂过程又能正常进行的条件下获得的。由于被处理的材料小，离开了母体， 细胞代谢的能源被中断，加上处于严重缺氧和有毒的恶劣环境中，一旦处理时间太长或毒 害太大，细胞将会因缺氧
