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1、荧光分析法测定药品中的羟基苯甲酸异构体含量一实验目的1. 学习荧光分析法的基本原理和操作；2. 熟悉荧光分析法进行多组分含量的测定方法。二实验原理1、荧光分析法原理：当被测物质受到光照后，被测物分子吸收了具有特征频率的辐射能，分子 从基态上升到激发态，分子在较高能级的激发态时，它可能处于激发态中各种 振动状态的一种。然而由于分子通过与溶剂分子、同类分子或其他分子的碰 撞，而失去振动能级，降低至激发态时的最低振动能级，在此过程中并不发 光。但当分子从激发态的最低振动能级，即第一电子激发态的最低振动能级跃 迁至基态的各个不同的振动能级时， 则以光的形式辐射出能量，所辐射出的光 既是荧光。2、激发光
2、谱和发射光谱：激发光谱：荧光是光致发光，因此必须选择合适的激发光波长，这可以从它们的激发 光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲线时，选择荧光的最大发射波长为测量波 长，改变激发光的波长，测量荧光强度的变化。以激发波长为横坐标、荧光强 度为纵坐标作图，即得到荧光化合物的激发光谱。激发光谱的形状与吸收光谱 的形状极为相似，经校正后的真实激发光谱与吸收关顾不仅形状相同，而且波 长位置也一样。这是因为物质分子吸收能量的过程就是激发过程。 发射光谱：发射光谱简称荧光光谱。如果将激发光波长固定在最大激发波长处，然后 扫描发射波长，测定不同发射波长处的荧光强度，即得到荧光光谱。3、试验方法机理：邻- 羟基苯甲酸（
3、亦称水杨酸）和间 - 羟基苯甲酸分子组成相同，均含 一个能发射荧光的苯环，但因其取代基的位置不同而具有不同的荧光性质。在 pH=12的碱性溶液中，二者在310nm附近紫外光的激发下均会发射荧光；在 pH=5.5的近中性溶液中，间-羟基苯甲酸不发荧光，邻-羟基苯甲酸因分子内形 成氢键增加分子刚性而有较强荧光，且其荧光强度与pH=12时相同。利用此性 质，可在pH=5.5时测定二者混合物中邻-羟基苯甲酸含量时，间-羟基苯甲酸 不干扰。另取同样量混合物溶液，测定pH=12时的荧光强度，减去pH=5.5时 测得的邻-羟基苯甲酸的荧光强度，即可求出间-羟基苯甲酸的含量。已有研究 表明，二者的浓度在012
4、 口 g/mL范围内均与其荧光强度呈良好的线性关 系，且对-羟基苯甲酸在上述条件下均不会发射荧光，不会干扰测定，故而亦可 在邻-羟基苯甲酸、间-羟基苯甲酸、对-羟基苯甲酸三者共存时，用上述方法测 定出邻 -羟基苯甲酸和间-羟基苯甲酸的含量。三主要仪器和试剂1、仪器：荧光分光光度计、1cm石英样品池、10mL比色管、吸量管、容量瓶、烧 杯、吸耳球。2、试剂：令卜 羟基苯甲酸标准溶液：100 口 g / mL （水溶液）；间-羟基苯甲酸标准 溶液：100 口g / mL（水溶液）；HAc-NaAc缓冲溶液：47gNaAc和6g冰醋 酸溶于水并稀释至1L,得pH=5.5的缓冲溶液；NaOH 水溶液；
5、0.1mol/L； 乙醇（95%）；医用水杨酸软膏。四实验内容1.配制标准系列和未知溶液分别移取 1.00ml 、2.00ml 、3.00ml 、4.00ml 和 5.00ml 邻- 羟基苯甲 酸标准溶液于已知编号的 10mL 比色管中，各加入1.0 mL pH5.5 的 HAc-NaAc 缓冲液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。另外分别移取 1.0ml、2.00ml 、3.00ml 、4.00ml 和 5.00ml 间- 羟基苯 甲酸标准溶液于已编号的 10mL 比色管中，各加入 1.00 mL 0.1mol/L 的 NaOH 水溶液，用去离子水稀释至刻度，摇匀备用。2样品溶液配制取约0.2
6、g水杨酸软膏，加50%乙醇约25ml，振摇使水杨酸溶解，放冷至室 温，用定性滤纸过滤除去ZnO,用蒸馏水稀释至500ml，用吸量管准确移取1.00ml该样品溶液于100ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，用于样品 测定。取上述溶液各1.00mL于10mL比色管中，其中一份加入1.00mL pH5.5 的HAc-NaAc缓冲液，另一份加入1.00mL 0.1mol/L的NaOH水溶液，均用去 离子水稀释至刻度，摇匀备用。3. 打开氙灯光源，后打开光度计主机光源，再打开计算机主机光源，预热15min。4. 设定激发狭缝，发射狭缝，扫描速度，扫描波范围和灵敏度档。5. 荧光激发光谱和发射光谱的测
7、定，选取激发光长和发射波长。6. 测量各标准系列溶液荧光强度，绘制标准曲线。7. 测量未知溶液的荧光强度，由标准曲线求出样品中邻-羟基苯甲酸和间-羟 基苯甲酸的含量。8. 实验完毕，先关闭主机和显示器电源，再关闭光度计主机光源，最后关闭 氙灯光源。五思考题1.入ex和入em各表示什么含义？测量未知试样时，其激发波长和发射波长 如何获得？为什么对某种组分其入ex和入em应该基本相同？入ex是指荧光最大激发波长，入em是指荧光最大发射波长未知试样，不知最佳激发波长，可以先用能量较高能保证它激发的波长进 行扫谱，得到一条发射谱线。从发射谱线上可以得到一个峰值。再以此峰值作 为发射波长，反过来扫激发光谱。又可得一峰值，即为最佳激发波长。以最佳激发波长进行激发,可以得到最优的发射谱。但一般只要能量足够， 能使物质激发，就可以得到发射谱，确定最佳的发射波长。原子荧光是气态自由原子吸收光源的特征辐射后，原子的外层电子跃迁到 较高能级，然后又跃迁返回基态或较低能级，同时发射出与原激发辐射波长相 同或不同的辐射，从上述荧光强度的定义，可知只有在荧光的最大激发波长和 最大发射波长基本相同时，测定的灵敏度才会体到最高值。
