出口食品中蜡样芽孢杆菌检验方法1. 适用范围本方法适用于出口食品的检验1.1. 培养基和仪器培养基甘露醇卵黄多粘菌素琼脂(MYP)；胰酪胨大豆多粘菌素肉汤；酚红葡萄糖肉汤；硝酸盐肉汤；营养琼脂；l-酪氨酸营养琼脂；溶菌酶营养肉汤；改良V-P培养基；动力培养基；胰酪胨大豆羊血琼脂(TSSB)；Butterfield氏磷酸盐缓冲稀释液；亚硝酸盐试剂；V-P试剂；碱性复红染色液1.2. 仪器吸管：容量l.OmL和lO.OmL，具O.lmL刻度；菌落计数器；均质器；厌氧培养装置；涡动搅拌器；L形玻璃棒；恒温培养箱：30°C及36±1°C2. 样品的保存和送检待检样品应保持在6C以下运送并尽可能不使其冷冻送达实验室后，应保存于4C并尽快进行检验如在4d内不能进行检验，应将样品储存在一20°C,检验前再于室温下解冻脱水食品可在常温下送检和储存2.1. 样品的制备以无菌操作用灭菌刀、剪将样品剪碎称取50g放于无菌均质杯中2.2. 加450mL无菌磷酸盐缓冲稀释液于均质杯中以18000〜20000r/min均质2min制成1：10样品稀释液4.3•取1：10稀释液10.0mL加到含有90.0mL无菌磷酸盐缓冲液的稀释瓶中，充分混匀制成1：100的稀释液。
4.4.每个稀释度换用1支10.0mL灭菌吸管，按上述操作程序进行10倍递增稀释直至10一62.3. 检验步骤平板计数法取各稀释液0.1mL接种到MYP琼脂平板上用灭菌L形玻璃棒均匀涂布于整个琼脂表面每稀释度接种两个MYP琼脂平板将平板置于30°C培养24h选取具有15〜150个典型或可疑蜡样芽抱杆菌菌落的平板，进行计数并计算同一稀释度两个平板的平均菌落数蜡样芽抱杆菌在MYP琼脂平板上生成的菌落为微粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环如反应不典型，可继续培养24h再计数计数后，从每个平板至少选取5个已计数的菌落分别接种于营养琼脂斜面，于30C培养24h，按第6章进行证实试验根据证实试验确定为蜡样芽抱杆菌的菌落数，按比例计算出该皿内的蜡样芽抱杆菌菌落数，然后乘其稀释倍数再乘以10，即得每克样品所含蜡样芽抱杆菌数并作出报告例：将检样10－4稀释液0.1mL涂布于MYP琼脂平板上，生成的可疑菌落数为25个，取5个进行鉴定，证实为蜡样芽抱杆菌的是4个，则1g样品中蜡样芽抱杆菌数为（25X4/5）X104X10=2X22.4. 最近似值（MPN）法适用于污染蜡样芽抱杆菌数不大于103个/g的食品选用三管法MPN系列。
取10－1、10－2、10－3三种稀释液，每种稀释液接种3管胰酪胨大豆多粘菌素肉汤，每管接种1mL置于30C培养48±2h从长菌的试管取培养物划线接种到MYP琼脂平板上置30C培养24〜48h从MYP琼脂平板上挑取粉红色绕有沉淀环的单个菌落，接种营养琼脂斜面，置30C培养24h，供作证实试验根据证实试验确定为蜡样芽抱杆菌的管数，由MPN表〔附录C（补充件）〕计算蜡样芽抱杆菌的MPN值/g,并作出报告2.5. 证实试验形态观察取营养琼脂斜面培养物，作革兰氏染色镜检蜡样芽抱杆菌为革兰氏阳性大杆菌，呈短链或长链，芽抱呈椭圆形位于菌体中央或偏端，不使菌体胀大2.6. 生化学性状葡萄糖发酵试验：接种于酚红葡萄糖肉汤中，厌氧条件下35C培养24h培养基应由红色变为黄色（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）硝酸盐还原试验：接种于硝酸盐肉汤中，35C培养24h加硝酸盐试剂后应为阳性反应（红色）V-P试验：接种于改良V-P培养基中，35C培养48h加V-P试剂及肌酸数粒，静止1h，应为阳性反应（伊红色）L-酪氨酸分解试验：接种于L-酪氨酸琼脂培养基上，35C培养48h，阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区（表示产生酪蛋白酶）。
阴性时应继续培养72h再观察溶菌酶试验：用直径2mm接种环取纯菌悬液一环，接种于溶菌酶肉汤中，35C培养24h该菌在本培养基（含0.001%的溶菌酶）中能生长如出现阴性反应，应继续培养24h卵磷脂酶试验：接种于MYP琼脂平板上,35°C培养24h阳性反应菌落周围应出现沉淀环（表示产生卵磷脂酶）2.7. 蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验动力试验：用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中，30C培养24h有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长,形成所谓的蜂巢状扩散也可用悬滴法检查蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼,而炭疽杆菌则不运动根状生长试验：用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上，30C培养18〜24h蜡样芽抱杆菌群的多数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长的特征溶血试验：取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，30〜32C培养24h蜡样芽抱杆菌落周围呈现0型完全溶血的溶血环苏云金芽抱杆菌和蕈状芽抱杆菌呈现弱的溶血现象，而炭疽芽抱杆菌通常为不溶血蛋白质结晶毒素试验：取经30C培养24h并于室温放置2〜3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏水混涂成薄膜。
经自然干燥，微火固定后，于涂膜加甲醇半分钟后倾掉，再通过火焰干燥，于载片上滴满0.5%碱性复红液，放火焰上加热微见蒸气（勿使染液沸腾）后持续1.5min,移去火焰，使载片放置0.5min再倾去染液用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检观察有无游离芽抱和染成黑色的菱形毒素结晶体如发现游离芽抱形成的不丰富，应将培养物置室温2〜3d再行检查苏云金芽抱杆菌用此法检测为阳性，而蜡样芽抱杆菌群的其他菌种则为阴性结果解释及报告：符合蜡样芽抱杆菌群的特征，有活泼的动力，很强的溶血能力，不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素，可报告为蜡样芽抱杆菌对偶尔遇到的一些少数可疑菌株，可以根据需要进行其他试验如青霉素酶、噬菌体试验等。