荧光素酶报告实验1 扩增目的片段扩增包含靶基因与miRNA互补位点的3'UTR序列以及mutant序列，上下游引物5'端各含 有不同的酶切位点和保护碱基(如Pme I，Spe I)；电泳检测目的条带，看大小是否正确， 然后用试剂盒纯化PCR产物备用主要采用了 2种方法进行序列突变及扩增，如下图所示： 第一种方法：1.2取1-2 gg纯化的目的片段或pMIR-REPORT载体，按酶切反应体系配制混合液进行酶切 (加0.01% BSA)，酶切3h后，80°C灭活5 min,冰上降温酶切产物进行胶回收酶切体系ComponentVolume (yl)H2O16-xVector or DNAxNEB Buffer I 或 IV2Spe I1Pme I1Total voloume20连接体系ComponentVolume (yl)H2O8-m-nVectormDNAn10XT4 Ligase Buffer1T4 DNA Ligase1Total voloume101.3配制连接反应混合液（DNA和Plasmid的molar ratio为3:1到6:1）, 16°C连接过夜或室 温连接10 min连接完毕后,将连接产物转化入感受态大肠杆菌（热激法）。
Amp（100 yg/ml） 抗性培养板筛选阳性克隆，菌落PCR鉴定目的片段，送3个样本测序，提取质粒酶切鉴定 等并扩繁阳性克隆重组 Luc-3'UTR 质粒主要元件和组成如下图所示（重组 Luc-3' UTR-Mut 原理相同）：Luciferase3' UTRpolyApLuc-MET 3'UTR 荧光素酶报告基因载体的构建4. 接种对数生长期的HEK293细胞（10% FBS+90% DMEM培养）于96孔板，3X103个/孔, 每个实验组设置6个复孔，37C，5% CO2培养箱中培养24h；5. 根据Lipofectamine 2000转染试剂说明书，配制转染液，转染HEK293细胞；A液pLuc-3'UTR0.1 ygpRL-SV400.05 ygMimic/NC100 nM 终浓度OPTI-MEM25 ylLipofectamine 2000 0.5 ylOPTI-MEM 25 yl6转染48 h后，吸除96孔板中的培养液，用ddH2O稀释Passive Lysis Buffer至1X浓度， 在96孔板中加入1X Passive Lysis Buffer，20 yl/孔,用移液枪反复吸打裂解细胞；7在白色不透明的96孔板中加入100 yl/孔的Luciferase Assay Substrate；8从每孔裂解好的细胞悬液中吸出11.5 yl加入Luciferase Assay Substrate中混匀；9在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据；10 用 Stop & Glo® Buffer 稀释 Stop & Glo® Substrate 至 1X 使用浓度；11 在第 7 步完成后，加入 Stop & Glo® Substrate 100 yl/孔,混匀；12在酶标仪500 ms条件下检测，并记录数据，两次测得数据的比值代表各孔样本的相对荧 光强度。