一、关于NEBM0202T4DNA连接酶的使用方法和常见问题及解答1、产品特性和使用方法产品说明：该酶催化契合的双链DNA或RNA的5'-磷酸末端和3'-羟基末端形成磷酸二酯键该酶不仅能够催化平滑末端或粘性末端DNA之间的连接，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA杂交双链中的单链切口(1)来源：源于E.coliC600pcl857pPLc28lig8(2)应用：限制性酶切片段的克隆(3)将linker或adapters连接到DNA片段的平滑末端反应缓冲液：1XT4DNALigaseBuffer:[50mMTris-HCI,10mMMgCI2,10mMDTT,1mMATP,25yg/mlBSA,(pH7.5@25°C)]推荐DNA浓度(0.1-1yM的5'末端)使用注意：ATP是反应必须的辅因子这一点与要求NAD作辅因子的大肠杆菌DNA连接酶不同如在反应体系中补加1mM的ATP，连接反应还可以在NEB提供的四种限制性内切酶缓冲液(NEBuffers)或在T4DNA多聚核苷酸激酶缓冲液中进行质量保证：无核酸内、外切酶污染每批T4DNA连接酶均通过模拟克隆实验进行检测，该实验可以检测出待连接DNA末端的任何破坏。
结果表明〉99.9%的DNA末端未受任何降解单位定义(粘性末端活性单位)：在20yl连接反应体系、0.12yM(300yg/mI)的5'-末端浓度条件下，16OC反应30分钟，能使50%的经HindIII消化的入DNA片段连接所需的酶量定义为一个NEB单位一个粘端连接活性单位=0.015个韦氏(ATP-PP交换)单位(4)一个韦氏单位=67个粘端连接活性单位浓度：400,000units/ml和2,000,000units/ml贮存条件：50mMKCI,10mMTris-HCI(pH7.4),0.1mMEDTA,1mMDTT,200yg/mlBSA和50%的甘油，-20°C贮存热失活条件:65°C加热10分钟室温连接反应：为方便起见，连接反应可以在室温(20-25°C)条件下进行粘性末端连接：在20山反应体系中加入1山T4DNA连接酶，反应10分钟平滑末端连接：在20山反应体系中加入1山T4DNA连接酶反应2小时，或者加入1山高浓度T4DNA连接酶反应10分钟另外，NEB的快速连接试剂盒(QuickLigationKit,NEB#M2200V[15个反应])是独有的可以在室温5分钟条件下连接平滑末端和粘性末端的试剂盒。
图1：在25°C条件下，用1unit(1:400稀释后取1yI)T4DNA连接酶连接入DNA/HindIII片段(4-碱基粘端)不同反应时间的结果图2：在20yI反？y逑抵校?貌煌?康腡4DNA连接酶连接平滑末端的入DNA/HaeIII片段16七温育30分钟S1W»*™Ofm20"J3BT白CT图2：在20川反？□逑抵校?貌煌?康腡4DNA连接酶连接平滑末端的入DNA/HaeII片段16七温育30分钟iritaT4DNALiga»二、常见问题及解答Q1:有哪些潜在原因可导致用T4DNA连接酶连接后转化失败？A1：€反应体系内无ATP或Mg2+可导致连接失败：使用随酶提供的buffer或向其它兼容的buffer中加入ATP含ATP的Buffer保存超过1年，其内ATP可能会降解，导致连接失败当补加ATP时，确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用€反应体系中盐浓度过高或EDTA含量高都可导致连接失败：纯化DNAo€去磷酸化步骤完成后，CIP、BAP或SAP失活不彻底：根据厂家推荐的方法去除去磷酸化酶€DNA浓度过高导致连接后产生的均是线性DNA：保持总DNA浓度在1-10pg/ml之间。
€连接末端为单碱基突出末端：使用最高至5pl高浓度连接酶16OC过夜连接€插入片段和质粒没有磷酸化注意：如果载体已经去磷酸化了，而引物又没有磷酸化会导致连接失败，订购磷酸化的引物或对引物进行磷酸化€加入过多的连接混合物至感受态细胞：50pl感受态细胞应加入1-5pl连接混合物€插入片段太大，不能进行环化：降低插入片段的浓度，并使用高浓度连接酶16OC过夜连接€连接酶失活：用lambdaHindlll或其它可行的底物进行检测€连接混合物含有PEG且连接反应过夜：长时间地在含有PEG的条件下连接可导致转化效率降低，这可能是由于逐渐产生的大片段线性DNA抑制了转化效率快速连接试剂盒（NEB#M2200）的buffer含有PEG€电转化前没有提纯连接混合物：电转化必须去除buffer，否则盐会导致瞬间放电，击穿细胞可用透析或柱纯化的方法纯化连接混合物虽然快速连接试剂盒（NEB#M2200）buffer中含有的PEG不会导致击穿细胞，但是会抑制电转化，所以必须去除，可用柱纯化方法去除PEGQ2:解决转化问题时，还有什么因素需要考虑？A2：€感受态细胞出了问题：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞。
€细胞不是感受态：设置下面列出的实验对照，必要时更换新鲜感受态细胞€大肠杆菌不能很好的接受重组蛋白：试用pMAL系统（NEB#E8000S）表达MBP（麦芽糖结合蛋白）融合蛋白，或者试用其它不需要大肠杆菌的表达系统€连接的DNA片段含有反向重复的序列，不能用大肠杆菌筛选：如果可能去除重复序列，或试用其它不需要大肠杆菌的表达系统€插入序列来自哺乳动物、植物或者含有甲基化的胞嘧啶，会被很多大肠杆菌菌株降解：使用mcrA、mcrBC和mrr缺失菌株€重组子太大（＞10,000bp）不能进行化学转化：用电转化Q3：内切酶酶切反应后，有什么因素可以导致T4DNA连接酶连接和后续的转化失败？A3：€内切酶酶切不充分：如果酶切位点位于PCR产物的末端，识别位点末端侧需要加至少6个保护碱基用对照底物检测内切酶的活性€内切酶没有完全失活：如果内切酶不能热失活，用酚/氯仿抽提纯化DNA€内切酶的星号活性消化了载体或插入片段：跑胶检测DNA，如果存在多余的条带，减少内切酶使用量或减短反应时间€DNA或内切酶有外切酶或磷酸酶的污染，破坏了DNA末端：酚/氯仿抽提纯化DNA检查内切酶的质量检测资料和注意事项，如果连接QC不佳或外切酶活性高，减少内切酶量或縮短反应时间。
Q4：使用T4DNA连接酶，需要设置什么对照来检测细胞和DNAoA4：注意：每个对照组都使用相同浓度的DNA，一般为0.1-1.0ng/转化€转化空载体（未切割的）至感受态细胞，目的：检测感受态细胞的质量以及质粒的抗性分别涂布于含有和不含有抗生素的平皿上€转化线性化后的载体，目的：检测未切开质粒的量，克隆数应该小于步骤1的1％€酶切再连接质粒，目的：检测连接酶的活性以及DNA末端的完整性克隆数应该与步骤1相近€酶切后去磷酸化再连接质粒，目的：检测未完全去磷酸化的背景克隆数应该小于步骤1的1％Q5：什么情况下选用T4DNA连接酶？A5：T4DNA连接酶应该被用来连接粘性末端（室温10分钟）或平末端（室温2小时），或者连接反应需要过夜如果需要热失活连接酶，选用用T4DNA连接酶高浓度T4DNA连接酶被用来连接单碱基突出末端，或连接需要长时间孵育来环化的大片段，比如BAC（细菌人造染色体）结构Q6：T4DNA连接酶能与快速连接buffer兼用吗？A6：可以，高浓度T4DNA连接酶可以直接取代，如果是普通浓度的T4DNA连接酶，将孵育时间从5分钟延长到15分钟不要进行热失活，因为加热会让buffer内的PEG抑制转化。
反应时间延长也会降低转化效率Q7：T4DNA连接酶连接应该加多少DNA？A7：单位定义用的是0.12pM（300pg/ml）lambdaHindHI高浓度的DNA用于linker的连接为了促进环化（有利于转化），应该控制总DNA浓度于较低水平载体+片段总浓度应为：1-10pg/mlo插入片段和载体的摩尔浓度比介于2-6之间，比例低于2:1会降低连接效率，高于6:1会促进形成多个插入如果对DNA的浓度不确定，可以做不同比例的多个连接反应Q8：T4DNA连接酶可在其它NEBuffers中使用吗？A8：连接可以在内切酶所有4个标准buffer和T4多聚核苷酸激酶的buffer中进行，但需要加终浓度为1mMATP确定补加的是核糖核酸ATP，而不是脱氧核糖核酸ATP，因为后者不起作用当使用NEBuffer3时，如果DNA中盐浓度较高可导致连接效率下降Q9：T4DNA连接酶可以热失活吗？A9：可以，65°C孵育20分钟可以失活如果buffer［快速连接试剂盒(NEB#M2200)内的buffer］中含有PEG则不可热失活，否则会抑制转化Q10：Weiss单位(韦氏单位)与NEB粘性末端单位如何换算？A10：一个NEB粘性末端单位等于0.015Weiss单位，即一个Weiss单位等于67个NEB粘性末端单位。
二、关于NEBM2200T4DNA快速连接试剂盒的使用方法和常见问题及解答1、产品特性介绍以及使用方法产品说明：本试剂盒可在室温(259)5分钟条件下，完成DNA片段粘性末端或平滑末端的连接反应应用：DNA片段克隆入载体文库构建TA克隆Linker连接线性DNA的再环化快速连接试剂盒的优点：快速-粘性末端或平滑末端DNA片段的连接只需5分钟即可完成方便-可在室温条件下进行连接反应灵活-适合于各种常规连接反应试剂盒成分：QuickT4DNA连接酶(重组酶)2XQuickLigationBuffer贮存条件(连接酶)：50mMKCI,10mMTris-HCl(pH7.4),0.1mMEDTA,1mMDTT,200yg/mlBSA和50%甘油2XQuickLigationBuffer：132mMTris-HCl，20mMMgCl2，2mMATP，15%Polyethyleneglycol(PEG6000)*，pH7.6@25°C美国专利号：4,582,802注意：连接缓冲液用前彻底混匀，避免反复冻融快速连接步骤:混合50ng载体和3倍摩尔量的插入片段，用蒸馏水调整总体积为10川加入10yl2xQuickLigationBuffer，混匀。
加入1ylQuickT4DNA连接酶，彻底混匀稍事离心，室温（25°C）作用5分钟冰上冷却，然后转化或贮存于-209不要热失活热失活会急剧降低转化效率转化步骤：快速连接产物可通过几种不同的方法进行转化，NEB推荐下述转化方法：冰上融化感受态细胞在1.5ml微量离心管中，将约5ng（2yl）的连接混合物冷却在DNA样品中加入50yl感受态细胞，通过反复吹吸温和混匀样品冰上放置30分钟37OC热休克2分钟，冰上冷却5分钟加入950yl室温培养基，37°C温育1小时取100yl样品铺在适宜的培养基上37OC培养过夜注意事项：用快速连接试剂盒能使大多数连接反应在25OC5分钟达到反应终点,超过这个时间效果并不会更好事实上，连接两小时后转化效率便会降低，如果25OC反应过夜，则转化效率会降至75%待连接的纯化DNA片段可以溶解在双蒸水（最好是Milli-Q超纯水）、TE或其它稀释缓冲液中要获得最适连接，在加2xQuickLigationBuffer前，调整载体DNA和插入片段的体积到10ylDNA片段体积大于10yl的，则相应增加2xQuickLigationBuffer的体积使之占总反应体积的50%，同样，DNA连接酶的。