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1、果糖及低聚果糖的分离、纯化目录一、除杂2二、脱色21. 活性炭脱色 22. 新生态碳酸钙法脱色 23. 树脂脱色 23.1 LSA-8 吸附树脂23.2 D318 树脂 24. 离子交换 2三、提纯 31分子量不同的糖的分离 31.1 纳滤分离31.2 分级纳滤分离31.3 柱层析凝胶分离42. 相同分子量的糖的分离 42.1 葡萄糖和果糖的分离42.1.1 化学试剂法42.1.2 吸附分离42.1.3 GOD-CAT 双酶法氧化52.1.4 复盐法52.1.5连续色谱分离（CSEP）53. 手性拆分 63.1分子印迹聚合物分离手性分子63.1.1功能单体的选择63.1.2 M I P s 的
2、制备63.2手性膜拆分法73.3 优先结晶方法 73.4 化学拆分法83.4.1 生成非对应异构体拆分法83.4.2 生物化学拆分法8参考文献9一、除杂1. 通过低温下冷冻和用乙醇-正己烷除去油脂和脂类物质；2. 加入磷酸和氢氧化钙，絮凝沉淀出果胶；3. 用盐析法、等电点法、溶剂沉淀法(sevage法)除去蛋白质；4. 加淀粉酶除去淀粉；5. 用阳离子聚丙烯酞胺吸附溶液中带负电荷的部分如蛋白质、多糖、蹂质、树胶、 淀粉和单宁等，最佳条件52C, pH=6, CPAM添加量为0.08%，絮凝时间3h.二、脱色1. 活性炭脱色通过极差最优化分析，确定出最佳影响因素pH脱色温度脱色时间活性炭 用量，
3、最优化工艺条件为:活性炭用量1.4%，脱色温度70C, pH值3.8,脱色时 间50min.【1】经试验验证的透光率为99.7%，同时在实验过程中用高效液相色谱 方法检测活性炭脱色后的低聚果糖溶液中低聚果糖含量，结果显示低聚果糖在脱 色前后并无损失.2. 新生态碳酸钙法脱色在低聚果糖液中加入 Ca(OH) 混合均匀后，再缓慢通入 CO 来反应生成碳酸 22 钙，这时新生态碳酸钙便与低聚果糖液中的色素发生吸附作用，从而达到脱色的 效果.在原样液锤度：190Bx透光率:92.31%, pH值:6.4电导率:26mV的条件下， 测试结果不如活性炭. 【1】3. 树脂脱色3.1 LSA-8 吸附树脂在
4、温度为70C, pH为6的条件下用脱色2h,实验结果色素的吸附率高达92.35%；【14】3.2 D318 树脂树脂用量为低聚果糖样品溶液的3.7%, pH=5.2,脱色时间3h,脱色温度为52C.4. 离子交换钟振声等选择了 D392大孔阴离子交换树脂对大豆低聚糖进行脱色，在与低聚糖 比为1:11的条件下,常温脱色3-4小时,色素的吸附率达86%.【14】三、提纯低聚果糖溶液中非有效成分葡萄糖、果糖、蔗糖，其相对分子质量分别为 180，180，342；有效成分蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖的相对分子量分别为 504，666，828.1分子量不同的糖的分离1.1 纳滤分离最佳条件：跨膜压差为1.
5、1 MPa，料液浓度为10 g/100 g,温度40C，循 环流量6 L/min, pH=6.【物料初始浓度30g/L、操作压力0.2Mpa、纯化15 倍. 【 12】1.2 分级纳滤分离先将样品通过0.3微米的微滤膜，将其透过液作为分级纳滤的母液.【1】采用 全回流方式，对样品共进行两级纳滤膜分离处理和一次反渗透膜回收处理.第一 级纳滤膜分离，在0.3MPa, 25 C,初始料液浓度为10倍稀释下，选用JN 1812-34 纳滤膜，对原始料液进行分离，之后三倍洗脱，截留蔗果五糖；第二级纳滤膜分 离，在0.4MPa, 25 C下，选用DK1812C-47D纳滤膜，对一级纳滤的透过液进行 分离，
6、截留蔗果三糖与蔗果四糖；经过两级纳滤和反渗透分离，可以将低聚果糖 溶液按其所含溶质的不同分为三部分，分别800部分为蔗果五糖、200800部分 为低聚果糖和200 部分为葡萄糖、果糖及部分蔗糖混合物. 最后对二级透过液进 行反渗透膜过滤，回收其中的葡萄糖、果糖等成分和大量的水.工艺流程图如下：泵200-30吩子量纳瀏二级纳滤二级纳橡谨过薇反豫透图分级纳滤分离工艺图Fig4-1 classification NF process chart为了避免因膜污染而造成的实验误差，每处理完一次样品后，均用蒸馏水对 纳滤装置和纳滤膜进行3次清洗，每次清洗时间约为8min.如果长时间（大于一 周）应该先用浓
7、度为 2%的表面活性剂进行清洗，最后用蒸馏水冲洗至无泡沫为止. 将清洗干净的膜管保存在 0.5%的甲醛溶液或 1%的亚硫酸氢钠溶液中，以防止长 霉长菌，损坏膜表面层实验证明，冲洗时间和浸泡时间分别为60 min和90 min 时二者都可使膜的纯水透过通量恢复系数达到100%左右.【13】1.3柱层析凝胶分离吸取一定量低聚果糖（过0.45微米的膜）均匀滴加在层析柱聚丙烯酞胺凝胶 表面，打开底部阀门，待低聚果糖刚好渗入凝胶时关闭阀门，用少量的脱气超纯 水洗下残留在柱壁上的糖液，打开阀门让洗脱液刚好渗入凝胶表面后关闭.接上 泵开始洗脱，同时将柱下端接在蒸发光散射检测器（N流速为2.5L/min，温度
8、为2100C）上直接进行检测分析.【1】在1.6cm*100cm的玻璃柱上最佳的层析条件:洗脱速度0 2 mL/min上样量 0. 5mI_（样液质量浓度0.4g/ml）、柱温40C，以Megazaae公司的标准品为对 照，经HPLC和MS分析，证明层析分离所得组分峰4峰、3和峰2分别是蔗果三 糖、蔗果四糖和蔗果五糖。而且经 HPLC 面积归一化法定量分析，证明分离产品 蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖蔗和果六糖的含量分别为99.9%、 99.94%、99.33% 和 97.89%。【17】 2.相同分子量的糖的分离2.1 葡萄糖和果糖的分离2.1.1 化学试剂法取混合物少许于洁净的试管中，然后滴
9、入澄清的石灰水，振荡，不久有沉淀 出现. 化学反应式如下：C6H12O6（葡萄糖）+ Ca（OH） 2 - C6H 06Ca（0H）2（葡萄糖化钙）6 12 6 2 6 12 6 2CH O （果糖）+ Ca（OH） +H0 - CH O Ca（OH） H 0 I （果糖化钙）6 12 6 2 2 6 12 6 2 2 把上述浊液进行过滤，取沉淀于盛有少量水的试管中，然后通入 CO ，又有沉淀 2出现.CO + CH O Ca（OH） H 0 CaC0 I + CH O + 2H 02 6 12 6 2 2 3 6 12 6 2 过滤后将滤液蒸发、结晶，即得果糖晶体.在上面滤出的葡萄糖化钙溶液
10、中通入CO，同样有沉淀出现.CO + CH O Ca（OH） CaC0 I + Ch O + 2H 026 12 6236 12 62过滤后将滤液蒸发、结晶，即得葡萄糖晶体. 【3】2.1.2 吸附分离2. 1. 2. 1聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂吸附分离柱为一根直径为8 mm,长为400 mm带有恒温夹套的玻璃柱柱内 填充经Ca2+离子交换后的聚苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂，先吸取一定量的糖 液,从吸附柱上方以一定的速度滴入,待糖液加完后,继续用同样的速度加蒸馏 水将糖份洗脱，整个加入液体的速度控制在与吸附柱流出液的速度近乎相等为 宜，以保持液面位置及柱内液体流速恒定在加完糖样同时开始在
11、吸附柱下端收 集流出液.【15】温度控制为(34.8-35.2)，洗脱液为去离子水最佳分离条件为：进 样质量分数10.5%、进样体积5 ml，洗脱速率0. 282 mL/min，在分离时间达到 100 min左右时，流出液中果糖含量可达90%(干基) 2.1.2.2模拟移动床(SMB)技术SMB 是一种利用色谱吸附分离原理进行液体操作的设备.它以逆流连续操作 方式，通过变换固定床吸附设备的物料进出口位置，产生相当于吸附剂连续向下 移动，而物料连续向上移动的效果.吸附塔内的吸附剂对果糖的滞留作用远大于 葡萄糖. 当精制后的糖液进入装有吸附剂的吸附塔后，果糖被吸附，而葡萄糖不 被吸附，在解吸剂的作
12、用下葡萄糖与解吸剂先从吸附塔一端流出，而果糖与解 吸剂最后流出，除去解吸剂，得到果糖和葡萄糖，达到分离的目的.为了连续高 效地分离，若干吸附塔串联，各部分进、出料口接上管线通过分配系统，经多通 旋转分配阀定时同时向前逐一切换，以实现连续分离经过SMB的分离操作后所 得产物的果糖含量高达90%. 【7】2.1.3 GOD-CAT 双酶法氧化在葡萄糖氧化酶的催化作用下把葡萄糖氧化生成葡萄糖酸和过氧化氢，形成 的过氧化氢被过氧化氢酶作用放出1/2 O，供反应体系的需要反应过程中，加2 入氢氧化钙调整反应 pH 值，使产生的葡萄糖酸与钙离子结合生成葡萄糖酸钙， 再结晶，经过分离纯化即可制得葡萄糖酸钙.
13、 这样就可将水解液中的葡萄糖和果 糖分离反应方程式如下：C6H2O6+6+CAIH2ChH2O1/2O2Cf,H2O7+Ca (OH )2Ca (Cf,H UO7 )2。出0最佳工艺条件:反应温度35C, pH5.5,酶用量GOD 85u/g葡萄糖，CAT 1235u/g 葡萄糖，底物浓度20% (w/v)，反应20h.2.1.4 复盐法混合糖液与氯化钙作用，生成果糖一 CaCl 的复盐，或与 NaCl 作用生成葡2萄糖-NaCl的复盐，然后使其自母液中分离.【7】2.1.5连续色谱分离(CSEP)用泵向树脂柱进料，进料液浓度为 50.54 g/100g，pH 值 4.0，体积 68m1，吸附
14、剂流向再循坏进料结束立即泵入去离子水，操作温度60C,进料、洗脱流速为7m1/min.收集 流出帳驻留时间为20mi議旌20min内进料站疝,洗脱水量7蒲1,洗脱回填 量535ml，再吸附区回填量495ml.由检测结果知，洗脱液（果糖产品）的纯度为 98.64%，果糖浓度 39.29%，葡萄糖产品中的葡萄糖纯度为 98.58%，果糖提取收 率 98.35% . 图中慢流出产品为果糖产品，快流出产品为葡萄糖产品，洗脱剂为 去离子水，吸附剂为树脂. 【7】3.手性拆分3.1分子印迹聚合物分离手性分子分子印迹技术主要在聚合过程中引入模板分子（包括原子、离子、分子、复合 物或分子、离子、大分子的聚集体
15、），通过模板分子与功能单体结合形成结合位 点，交联后将模板分子固定在聚合物中，随后除去部分或者全部模板分子，形成 孔穴，通过识别位点与分子印迹孔穴的共同作用来识别模板分子.采用该技术制 备的聚合物通常称为分子印迹聚合物（MIPs）.【8】3.1.1 功能单体的选择果糖中含有醇羟基，为弱酸性基团，易于与碱性功能单体形成氢键作用.因 此选择弱碱性的丙烯酞胺（AM）和2 一乙烯毗咙（2-VP）两种功能单体来制备MIPs. 利用 lH NMR 研究功能单体与模板分子通过氢键作用后醇羟基质子化学位移的变 化，确定分子上的醇羟基能够与功能单体发生氢键作用.3.1.2 M I P s 的制备在 5OmL 的两口烧瓶中加入一定量的模板分子，再加入适量乙腈作为致孔剂 . 加入一定比例的功能单体，超声通氮排氧，于冰水浴中预聚合8h.再加入EDMA 交联剂和引发剂之后超声l-2min，通氮气lOmin除氧，置于60C水浴中聚合 12h.聚合反应后得到的白色固体经粉碎、研磨、过筛，取粒径为20 一 60微米之 间的颗粒，用丙酮沉降三次，除去过小的颗粒，于60C下真空干燥后备用.将真空干燥
