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1、一、培养细胞常用配置培养基的配置：基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml冻存液的配置：10 % DMSO + 90%依次比例酌量配置。超净工作台常规配置移液器1套（山、20山、200山、1ml），酒精灯1盏，液器1台，斜架1台，酒 精喷壶1个，酒精棉球缸1个，污缸1个，常规耗材：培养瓶（50 cm 2）,定量移液管（5ml、10ml），枪头（1ml、200山、 10山），培养皿，6/2448/96孔板，医用脱脂棉球，冻存管所需试剂：培养基，胎牛血清，双抗，DMS0,胰酶，75%酒精实验前准备：所需的各项高压后的耗材及污物缸放于超净工作台内，用酒精喷壶 喷洒实验台面，并关闭工作台打开
2、紫外灯照射30min后开始实验操作。培养基及 胰酶恢复常温后使用，可37C水浴5-10min二、细胞复苏步骤：1. 紫外消毒 30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37C预热20min,备用。超净台内准备一支 15ml 离心管备用。3. 将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再将 瓶口对准在酒精灯上消毒 2-3 次，旋开瓶盖后需再次分别消毒瓶口和瓶盖。4. 从液氮保存罐中取出冻存管，立即放入37C水浴中，快速摇晃，直至冻存液 融化至黄豆粒大小后迅速取出。5. 将细胞悬液移入15ml离心管，缓慢加
3、入4ml培养液，离心（1000r/min, 5min）。6. 取出 2 个培养皿并做好标记（复苏日期等），提前加入 5-10ml 培养液；离心 结束后用 1ml 培养液悬液混悬沉淀细胞后分别加入培养皿内。7. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实 验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8. 将培养瓶放入培养箱内培养、.，Y -、八.，I 1* r-. T r注意事项：1. 取细胞的过程中注意带好防冻手套。此项尤为重要，细胞冻存管可能漏入液 氮，解冻时冻存管中的气温急剧上升，可导致爆炸。2. 冻存液的问题：冻存液的配置已是常识，在这里不作详述，但二甲基亚砜（DMSO
4、）对细胞不是完全无毒副作用，在常温下，二甲基亚砜对细胞的毒副作 用较大，因此，必须在 1-2min 内使冻存液完全融化。如果复苏温度太慢，会造 成细胞的损伤，二甲基亚砜（DMSO ）最好选择进口产品。3. 离心前须加入少量培养液。细胞解冻后二甲基亚砜浓度较高，注意加入少量 培养液可稀释其浓度，以减少对细胞的损伤。4. 离心问题：目前主要有两种见解。一种是解冻后的细胞悬液直接吹打均匀后 分装到培养瓶中进行培养，第二天换液。因为离心的目的是两个，去除 DMSO， 去除死细胞，这个是标准流程，但对一般人来说，把握不好离心转速和时间，转 的不够活细胞沉底的少，细胞就全被扔掉了，转过了活细胞会受压过大，
5、 死亡。 此外在操作过程中容易污染，所以不推荐。另一种说法为细胞悬液中含有二甲基 亚砜（DMSO）, DMSO对细胞有一定的毒副作用，所以须将离心后的液体前倒 净，且一定倒干净。5. 冻存细胞解冻时1ml细胞液要加10ml 15m培养液6. 复苏细胞分装的问题：复苏1管细胞一般可分装到2-3只培养皿中，分装过多， 细胞浓度过低，不利于细胞的贴壁。7. 加培养基的量放入问题：这个量的多少的把握主要涉及到的问题是 DMSO 的 浓度，从如果你加培养基的太少，那么DMSO的浓度就会比较大，就会影响细胞 生长，从以前的资料来看， DMSO 的浓度在小于%的时候对一般细胞没有什么影 响，还有一个说法是
6、1。所以如果你的冻存液的浓度是 10DMSO 的话那么 加 10ml 以上的培养基就恰好稀释到了无害浓度8. 原理：在不加任何条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成 冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、PH改变、 蛋白变性等，能引起细胞死亡。如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢 的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在一130C以下的低温 中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的一5 0C,细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO ）和 甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细
7、胞。三、培养液的更换1. 紫外消毒 30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。2. 培养液（DMEM），恒温水浴箱37C预热20min,备用。3. 将所需的培养基确保瓶身干净后酒精消毒放于工作台面内，点燃酒精灯，再 将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖。4. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸5. 拿出1支高压后的5ml定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身 2-3 次，悬空进入培养基瓶内吸取 5-10ml 培养基再悬空移入培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消
8、毒2-3次后盖上。6. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实 验试剂及污缸等，关闭超净工作台。7. 将培养瓶放入培养箱内培养每天定时观察细胞生长情况，一般 72-96h 后，细胞生长密度大于 90%，即可进 行细胞的传代。四、细胞传代1. 紫外消毒 30min 后关闭紫外灯，开启超净台正常工作状态，用酒精消毒操作 者的双手。2. 培养液，胰酶，恒温水浴箱37C预热20min,备用。3. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒精灯， 再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分 别放于酒精灯的两侧。4. 将培养
9、皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取 1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬 空沿皿壁加入培养皿内。5. 将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1-3min （消化时间 根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并 有1-2个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到 成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜 下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。6. 吸取 1ml 培养基于培养皿内，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗 培
10、养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽 可能处于单个悬浮状态。7. 取1或2个新的培养皿，然后将细胞培养基均匀的分到2或3个培养瓶内（注 意原来传代时使用的培养瓶可继续传代使用），进行1传2或1传3的培养。8. 拿出 1 支高压后的 5ml 定量移液管，在酒精灯上灼烧尾部后装于移液器上， 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身 2-3 次，悬空进入培养基皿内吸取 5-10ml 培养基悬空移入每个培养皿内，将培养皿盖在酒精灯上消毒 2-3 次盖上， 在皿盖上做好实验标记。9. 将培养基瓶口和瓶盖消毒 2-3 次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面，取出实 验试剂及污
11、缸等，关闭超净工作台。10. 将培养瓶放入培养箱内培养。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的 水，且定期更换确保无菌。每天定时观察细胞生长情况，一般 72-96h 后，细胞生长密度大于 90%，即可进 行细胞的传代或保株。五、细胞株的保存 原理：细胞冻存最常用的技术是液氮冷冻保存法，主要采用加适量保护剂的缓慢 冷冻法冻存细胞。细胞在不加任何保护剂的情况下直接冷冻，细胞内外的水分会 很快形成冰晶，从而引起一系列不良反应。如细胞脱水使局部电解质浓度增高， pH 值改变，部分蛋白质由于上述原因而变性，引起细胞内部空间结构紊乱，溶 酶体膜由此遭到损伤而释放出溶酶体酶，使细胞内结构成分造成破坏，线粒体
12、肿 胀，功能丢失，并造成能量代谢障碍。胞膜上的类脂蛋白复合体也易破坏引起细 胞膜通透性的改变，使细胞内容物丢失。如果细胞内冰晶形成较多，随冷冻温度 的降低，冰晶体积膨胀造成细胞核 DNA 空间构型发生不可逆的损伤，而致细胞死 亡。因此，细胞冷冻技术的关键是尽可能地减少细胞内水分，减少细胞内冰晶的 形成。采用甘油或二甲基亚砜作保护剂，这两种物质分子量小，溶解度大，易穿 透细胞，可以使冰点下降，提高细胞膜对水的通透性，且对细胞无明显毒性。慢 速冷冻方法又可使细胞内的水分渗出细胞外，减少胞内形成冰结晶的机会，从而 减少冰晶对细胞的损伤。实验步骤：选择处于对数生长期的细胞，在冻存前一天最好换液。将多个
13、培养瓶中的细胞培 养液去掉，用% 胰蛋白酶消化。适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。用吸管 吸取培养液反复吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。悬浮生产细 胞则不要消化处理。然后将细胞收集于离心管中离心（1000r/min,10分钟）。加 入冻存管中，再加入1ml配置好的冻存液后放入梯度降温盒，放入-80C冰箱中。1. 紫外消毒 30min 后关闭紫外灯,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作 者的双手。2. 培养液，胰酶，二甲基亚砜DMSO，胎牛血清（解冻），梯度降温盒恢复常温, 恒温水浴箱37C预热20min，备用。3. 将所需的培养基，胰酶确保瓶身干净消毒后放于工作台面内，点燃酒
14、精灯， 再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3次，旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖，分 别放于酒精灯的两侧。4. 将培养瓶瓶口在酒精灯上消毒2-3次，旋开后分别再次消毒瓶口和瓶盖2-3次， 盖放于酒精灯右侧后将培养瓶内的培养液悬空倒进污缸，在酒精灯消毒2-3次瓶 口，竖直放好。取1ml移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头 吸取胰酶液，悬空移入培养瓶内。5. 将培养皿盖内口朝上放在架子上，将培养皿内的培养液悬空倒进污缸。取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2次，然后再装上枪头吸取1-2ml胰酶液，悬 空沿皿壁加入培养皿内。6. 将培养皿来回倾倒使胰酶浸没整个皿底的细胞层，计时越1
15、-3min （消化时间 根据细胞不同时间不同），对着灯光可观察到细胞与细胞之间有针孔样缝隙，并 有1-2 个细胞脱落，镜下观察到细胞都变圆时为胰酶消化的最适时机。（若看到 成片的细胞从瓶壁脱落为胰酶消化过度；若看不到针孔样缝隙和细胞脱落，或镜 下细胞多有菱角则需继续消化）。用移液器将胰酶吸净。6. 吸取 1ml 培养基于培养皿，并用移液器吸取少量的培养基轻柔的反复冲洗培 养瓶壁5-8次，使贴壁细胞完全脱落于培养基内再轻轻吹打2-3次，使细胞尽可 能处于单个悬浮状态。7. 将悬浮细胞吸入15ml离心管内，加入4ml培养基离心1000r/min，5min8. 预先配制冻存液：10 % DMSO +
16、 90%。按需要配置一定数量备用9. 弃去培养基，用冻存液进行重悬混匀后，将 1ml 含有细胞的冻存液移入冻存管 内，拧紧瓶盖，做好实验标记。10. 将培养基，胰酶瓶口和瓶盖消毒2-3次后拧紧，熄灭酒精灯，整理实验台面， 取出实验试剂及污缸等，关闭超净工作台。8.将冻存管先放于4C冰箱30min后拿出放置-20C冰箱过夜，次日再放于-80C 的冰箱内3-4天，最后存放于-196C的液氮灌内长期保存。或直接放入梯度降温 盒内，放入-80C冰箱内过夜后最后存放于液氮罐内。（梯度降温盒内为甲醇， 使用5次需要更换，每次使用需做好标记，使用前需恢复常温）六、细胞转染RNA 干扰(RNA int erference, RNAi): 是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA (dou
