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1、Methods for the quarantine and identificatioPnhytoofphthora sojae Kaufmann & GerdemannSNT 1132002前言本标准的附录B是规范性附录，附录A是资料性附录。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：彭金火、张大凯、金林。 本标准系首次发布的出入境检验检疫行业标准。1 范围 本标准规定了进出境植物检疫中大豆疫霉病菌的检疫和鉴定方法。 本标准适用于大豆夹带土壤中大豆疫霉病菌的检疫和鉴定，同时也适用于大豆疫病已发生地区大豆疫霉病菌的
2、土壤分离和鉴定。2 规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所用的修改单(不包括勘误的内容)或修订版均不适用 于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。GBT 18082000植物检疫 小麦矮化腥黑穗病菌检疫鉴定方法大豆疫霉病菌 检疫鉴定方法3 原理3.1 大豆疫霉病菌的分类地位大豆疫霉病菌(Phytophthora sojae Kaufmann & Gerdem，an异n 名P.megasperma f.spglycinea Kuan&Erwi和n P.m
3、egasperma varsojae Hildebrand)属鞭毛菌亚门(Mastigomycotina)，卵菌纲(Oomycetes)，霜霉目(Peronosporales)，腐霉科(Pythiaceae)，疫霉属(Phytophthora)，可 侵染任何生育阶段的大豆寄主，包括根、茎、叶、豆荚和种子，但以引起大豆根腐病和茎腐病较为普遍，英文名：Soybean Phytophthora stem and root r，ot简称大豆疫霉病。3.2 检疫原理 该病原真菌是典型的土壤习居菌，主要以抗逆性很强的卵孢子在土壤中和土壤中的寄主残体内越冬并长期生存。当田间温度和湿度适宜时，卵孢子打破休眠萌
4、发，产生孢子囊。雨后或灌溉后有积水时，孢子囊很快释放出大量游动孢子，游动孢子被雨水冲溅到寄主表面，或受寄主分泌物的吸引，朝根系游动并最终侵染寄主。有水时，在寄主根部外表形成大量孢子囊，在内部形成大量卵孢子。本标准根据病原菌的这一特性，先收集土壤并在适宜条件下培养一定时间，使卵孢子萌发产生孢子囊，然后加水浸泡，使孢子囊释放出游动孢 子，再加感病大豆品种的叶碟诱集游动孢子，待游动孢子侵染叶碟并在叶碟边缘(偶尔在叶碟表面)产生新的孢子囊并释放出游动孢子时，即可进行病 原菌的分离和鉴定。3.3 鉴定原理 大豆疫霉病菌的生物学特性、形态学特征等与其他疫霉种不同，是鉴定该病原菌的依据。4 仪器设备4.1
5、生物显微镜(具油镜镜头)4.2 目镜和镜台测微尺4.3 具透射光源的体视显微镜(最大放大倍数不低于50倍)4.4 干热灭菌器4.5 高压灭菌器4.6 普通天平(感量1100)4.8 超净工作台4.9 生物培养箱(具4 000以lx上的光照)4.10 酒精灯4.11 铁臼4.12 医用注射器(10 mL针头(18号)4.13 医用手术剪、镊子4.14 烧杯(5 m50 ml 000 mL)4.15 试管(直径12 mm)4.16 培养皿(直径9 cm)4.17 载玻片(25.3 mm 76.2 m，厚0.8 mm)4.18 盖玻片(18 m18 mm)4.19 三角瓶(250 mL)4.20 量
6、筒(500 mL)4.21 滴管4.22 Parafil膜m 或无色透明塑料袋5 药品5.1 抗菌素及杀菌剂5.1.1 苯莱特(benomyl，研究用纯粉剂或市售可湿性粉剂)5.1.2 制霉菌素(nystatin，研究用纯粉剂或市售医用内服片剂)5.1.3 青霉素(penicillin，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂)5.1.4 氯霉素(chloroamphenicol，研究用纯粉剂或市售医用注射粉剂)5.2 席尔氏浮载剂见GBT 18082000附录A。5.3 琼脂粉5.4 无荧光显微镜物镜镜头油(Nd=1.516)5.5 永久封片剂6 培养基及用途6.1 基础培养基 用于病原菌的保存和培养
7、性状的观察、测定。 建议采用绿豆培养基(GGA)，利马豆培养基(LBA)或V8培养基(V8A)，其配制方法及步骤见附录A.1。6.2 半选择性培养基用于大豆疫霉病菌游动孢子的萌发、菌株的纯化和病原菌的分离及再分离。4.7 分析天平(感量110 000)霉素10 mg(均为有效成分)。其中研究用纯苯莱特粉剂和纯氯霉素粉剂需事先配制成酒精溶液(母液)，并使培养基中的最终酒精浓度不大于0.5。1 000基mL础培养基经常规灭菌并冷却到55左右时加入下列抗菌素，摇匀，倒平板：制霉菌素4 m苯来特2 m青霉素250 m500 m 氯6.3 液体培养基用于病原菌的液体培养以及产生孢子囊。 建议采用豌豆液体
8、培养基，其配制方法及步骤见附录A.2。7 检疫方法和程序7.1 土壤样品的收集7.1.1 现场取样 仔细从大豆中挑拣土壤。7.1.2 加工过程中取样大豆制油加工流程中通常需去除杂质，杂质可粗分为三类，即石块、土块等比重大的，筛上物(豆杆等)和筛下物(豆皮、杂草籽等)。从筛上物和石块中即能收集到土块。一般每1 000 大t豆可收集到50g 500土g 壤。每10 000 大t豆至少检测20份土样。7.2 土样的准备称量土块，每份10，g 逐份在铁臼中碾碎，除去新鲜的植物组织，盛入50 m灭菌洁净烧杯内。7.3 加水每份土样加4 m7 m 菌蒸馏水，使土壤呈饱和湿润状态，但避免出现流动水，然后用p
9、arafilm膜封口保湿，也可用无色透明塑料袋保湿。7.4 培养将湿润并封好口的土样置于2226、光照条件下放置4d 6 。d7.5 浸泡和诱集在按6.4处理后的土样中加灭菌蒸馏水10 m15 m，水面距土表1.0 c1.5 c，然后加20片左右直径4 m5 m的大豆叶碟，尽量使大豆叶碟铺满水面，诱集12h 24。h 诱集用大豆叶碟以感病品种如HAR01-7、WILLIAMS、合丰25号等较好。7.6 叶碟培养和检查将诱集后的大豆叶碟取出，灭菌蒸馏水冲洗2次，移到具15 m20 m菌蒸馏水的培养皿内， 2226光照条件下培养24h 72，h 然后在体视显微镜下检查叶碟边缘和表面有无孢子囊。受大
10、豆疫霉侵染的叶碟通常呈棕色至浅褐色，或叶碟退绿，叶碟边缘无菌丝，仅有单生或数根孢囊梗，孢囊梗一般不分枝；受其他真菌(如腐霉Pythium spp.色。7.7 游动孢子萌发细菌侵染的大豆叶碟的边缘黑褐色，边缘无菌丝或有大量菌丝；未受侵染的叶碟仍为绿如发现少量孢子囊，可将有孢子囊的叶碟转移到具1 m左右灭菌蒸馏水的5 m杯中，待孢子囊释放出游动孢子后(一般需1h 4 h，吸取该悬浮液至半选择性培养基平板上，置于2226、黑暗条件下培养，使游动孢子萌发；如孢子囊和游动孢子较多(10个孢子囊以上)，直接从培养皿吸取悬浮液进行游动孢子的萌发。7.8 萌发游动孢子的单孢分离及培养游动孢子培养4h24后h
11、，在体视显微镜下挑取萌发的单个游动孢子至半选择性培养基平板上，置于2226、黑暗条件下培养。如大豆叶碟上没有或只有少量腐霉污染，可在4后h 进行单孢分离，否则24后h 进行。上述单个萌发游动孢子分离物在培养过程中如存在污染，应在半选择性培养基上进行二次至三次纯化。制霉菌素和苯来特可用多菌灵代替(10 mg)；氯霉素可用利福平(10 mg)代替；青霉素可用安苄青霉素(250 mg500 mg)代替。7.9 孢子囊的保存和制片镜检在用剩的游动孢子液中新加一些大豆叶碟，以便产生新的侵染并形成孢子囊。将带有孢子囊的叶碟移入席尔氏浮载剂中，孢子囊可保存较长时 间。进行孢子囊的形态观察和测量时，将上述保存
12、的孢子囊连同叶碟取出制片。 镜检时，注意观察孢子囊的形状、大小、有无乳头状突起和孢子囊梗的生长方式。7.10 菌株纯化致病性测定的方法及步骤见附录B。8 鉴定特征8.1 培养特征 大豆疫霉在GGA、LBA和V8A等三种基础培养基上，菌落平展而均匀，边缘光滑，无色；气生菌丝少至中等，絮状，乳白色；菌落边缘的菌丝无隔，宽3 m9 m，近直角分枝，分枝繁复，短而尖锐，刺状。在黑暗和适宜温度(2226)条件下，菌落生长较缓慢，生长速度一般小于5 md。8.2 无性生殖阶段特征 孢子囊梗单生或简单分枝，内生层出型。孢子囊顶生，倒梨型，偶有长椭圆型，23m89 m17 m52m，长宽比大于1.6；无乳突，
13、顶部偶见增厚。游动孢子在孢子囊内形成，通过 孢子囊顶部的排孢孔释放；偶见游动孢子不释放而在孢子囊内直接萌发产生芽管，穿透孢子囊壁生长。8.3 有性生殖阶段特征同宗配合，单个游动孢子后代在基础培养基平板上培养3d 7后d 可自交产生雄器和藏卵器，藏卵器内生一个卵孢子。雄器不规则形，大多侧生，少数围生。藏卵器壁薄，表面光滑无饰纹，球形至亚球形，直径29m58 m，平均32 m4l m。 卵孢子壁厚，光滑，直径26 m40 m。8.4 致病性特征采用下胚轴创伤接种法进行致病性测定时，大豆植株应在1d 3内d 全部发病并萎蔫死亡。8.5 病原菌再分离在病健交界处但远离接种点的部位，切取数段长1 m左右
14、的发病植株茎杆，直接放置在半选择性培养基上进行分离培养。注意观察再分离到的菌 株的菌落生长速度、菌落特征、菌丝特征、藏卵器及雄器特征和卵孢子的特征。必要时，对再分离物采用菌丝丛水培法，刺激分离物形成孢子囊进行 观测和测量，作进一步鉴定，方法如下：每皿(直径9 cm15 m20 m豌豆液体培养基，移入8块10块新鲜培养的疫霉菌丝块(直径2 m左右)，25、黑暗条件下培养3d 5。d 待菌丝丛形成后，倾取培养液，加入15 m20 m菌蒸馏水重新悬浮菌丝丛，每皿可加入土壤浸出液(配制方法见附录A.3)3滴5滴，置于25、黑暗条件下培养。以后每隔12h 24换h 一次水，并加入3滴5滴土壤浸出液，直至孢子囊大量产生。9 结果评定如分离物的培养特征、无性及有性阶段特征、致病性特征及再分离菌株的性状与第7章鉴定特征吻合，鉴定为大豆疫霉病菌。10 菌
