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1、目 录摘要IAbstractII1 前言11.1 蜘蛛毒素的组成11.1.1 蜘蛛毒素的蛋白质类成分11.1.2 蜘蛛毒素的多肽类成分21.2 多肽类蜘蛛毒素的研究现状21.2.1 作用于电压门控钠离子通道毒素31.2.2 作用于电压门控钾离子通道毒素41.2.3 作用于电压门控钙离子通道毒素41.3 已研究的敬钊毒素概况61.4 JZTX-XI的研究状况81.5 固相合成的优缺点101.6 固相合成的研究发展前景112 实验部分122.1 固相合成的基本原理122.1.1 树脂的选择和氨基酸的固定122.1.2 氨基、羧基、侧链的保护和去除132.1.3 缩合反应与裂解132.2 实验试剂与
2、仪器142.3 实验方法142.3.1 多肽的仪器合成与裂解142.3.2 多肽的分离纯化与质谱鉴定152.3.3 合成肽的复性摸索152.3.4 JZTX-XI 突变体M5A-JZTX-XI的合成、复性和分离纯化163 结果与讨论173.1 JZTX-XI的固相合成结果173.2 JZTX-XI的氧化复性结果193.3 M5A-JZTX-XI的合成和复性结果203.3.1 合成的M5A-JZTX-XI反相HPLC和质谱203.3.2 复性223.4 影响多肽固相化学合成条件的讨论243.4.1 合成的环境和试剂要求243.4.2 氨基酸侧链基团对合成的影响253.4.3 固相肽合成仪的影响2
3、53.4.4 树脂和催化剂的影响253.4.5 裂解时间的影响263.5 影响合成多肽的氧化复性条件的讨论26参考文献27致 谢29化学化工学院2010届本科毕业论文敬钊毒素-XI（JZTX-XI）及其突变体M5A-JZTX-XI的固相合成与复性摘要：敬钊毒素-XI(JZTX-XI)是从敬钊缨毛蛛(Chilobrachys jingzhao)粗毒中分离纯化到的一种新型的肽类神经毒素，由34个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸形成3对二硫键，其一级结构为：ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPTLKYCAWDGTF。为了研究JZTX-XI结构与功能的关系，用芴甲氧羰基(Fomc)固相多肽合
4、成方法仪器合成了天然JZTX-XI和突变体M5A-JZTX-XI，并通过反相HPLC和质谱对不同条件下的氧化复性结果进行监测，从而得到合成多肽的最佳氧化复性条件为：pH为8的0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液、1.0 mmol/L 的GSH、0.1 mmol/L 的GSSG，样品质量浓度为0.01 g/L，温度为4,时间为24 h。复性产物经质谱测定其相分子质量与理论分子质量相符。关键词：JZTX-XI；固相多肽合成；突变体；反相HPLC；氧化复性Synthesis and Folding of M5A-JZTX-XI：a Mutant of Jingzhaotoxin-XIAbstr
5、act： Jingzhaotoxin-XI (JZTX-XI) is a novel peptide neurotoxin isolated from the venom of the spider Chilobrachys jingzhao. It is composed of 34 residues with three disulfide bonds. The primary structure of JZTX-XI is ECRKMFGGCSVDSDCCAHLGCKPT LKYCAWDGTF.In order to investigate the structure-function
6、relationship of JZTX-XI, the natural JZTX-XI and mutant M5A-JZTX-XI were synthesized by solid-phase chemistry method with Fmoc-protected amino acids on the PS3 automated peptide synthesizer. Reverse-phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) and matrix assisted laser desorptionion ioniza
7、tion time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/TOF MS) were used to monitor the oxidative refolding of synthetic linear peptides to find the optimal renaturation conditions of toxins. When samples (0.01 g/L) were dissolved in 0.1 mol/L Tris-HCl buffer containing 1.0 mmol/L reduced glutathion (GSH)
8、 and 0.1 mmol/L oxidized glutathion (GSSG) at pH 8.0 and, 4，the best time is 24 h. the best renaturation yields of synthetic peptides were obtained. The experiments also proved that the relative molecular masses of renatured peptides were in accordance with their theoretical molecular masses.Key wor
9、ds： JZTX-XI; solid-phase synthesis; mutant; MALDI-TOF; oxidative foldingII1 前言 多肽是涉及生物体内各种细胞实现生理功能的重要物质，对于多肽的研究，当今世界已经出现了一个空前的繁荣景象。多肽的合成不仅具有很重要的理论意义，而且具有重要的应用价值。通过多肽合成，可以解决科研过程中许多棘手的问题：多肽合成可以验证一个新的多肽的结构；用于研究结构与功能的关系；设计新的多肽；为多肽生物合成反应机制提供重要信息；改造多肽分子；合成新的多肽药物等。 多肽的化学合成技术的发展近些年来迅猛发展。而近几十年来，固相法合成多肽以它省时、省
10、力、省料、便于计算机控制、便于普及推广的突出优势而成为肽类合成的最常用的方法。1.1 蜘蛛毒素的组成人们一般把蜘蛛毒素分子分为三大类：第一类是分子量1 kDa以下的小分子物质。第二类也是含量最丰富的一类，为分子量1到10 kDa之间的多肽类毒素。第三类是分子量10 kDa以上的蛋白质类。毒素中的小分子物质有很多种，以前的研究探明，蜘蛛毒素中的小分子物质主要有无机盐类（Na+、K+、Ca2+、Cl-）、氨基酸、核苷酸、有机碱、多胺类物质和神经递质（如多巴、GABA、肾上腺素）等1。目前，很多小分子物质的作用和意义还不清楚，有人认为小分子物质可能会加强毒素对猎物的伤害，还有人认为只是一些降解产物。
11、在对小分子物质的研究中，对多胺类物质的研究已经呈现一个新的领域。Gerard P. Ahern等人认为一些多胺类是潜在的辣椒素受体2。日本发现的多胺类小分子JSTX-33能阻断突触后膜的谷氨酸受体。通过对越来越多的多胺类物质结构的解析，发现多胺类的毒素都有一些共同的特点，分子头部通常是一个苯酚基团或是一个吲哚基团，分子尾部通常是一个胺基或是一个胍基，中间是多胺构成的主链4（见图1-1）。通过对多胺类的了解深入，人们开始意识到它们可以成为选择性作用于离子通道的工具试剂，在医药和科研上发挥更大的作用。1.1.1 蜘蛛毒素的蛋白质类成分蜘蛛蛋白质类成分富含多种活性酶，血蓝蛋白，未知蛋白，以及少量的毒
12、素蛋白。酶类主要包括：能量代谢相关酶类，如ATP合成酶、NADH脱氢酶、ATP-NAD激酶、乙酰辅酶A氧化酶、谷胱甘肽转移酶等；消化相关酶类，如淀粉酶等；脂类代谢相关酶类，如磷脂酶A1、阿朴脂蛋白酶等；其它酶类，如过氧化物酶、转移酶等。图1-1 蜘蛛毒液中多胺类常见结构血蓝蛋白又称血清素，是存在于某些软体动物和节肢动物中的一种游离的蓝色呼吸色素5。血蓝蛋白含两个直接连接多肽链的铜离子，它易与氧结合，也易与氧解离，是已知的惟一可与氧可逆结合的铜蛋白，氧化时呈青绿色，还原时呈白色。它是在某些软体动物、节肢动物（甲壳虫和蜘蛛）的血淋巴中发现的一种游离的蓝色呼吸色素。血蓝蛋白有多种催化作用，特别是变性
13、后，在特定条件下具有多酚氧化酶、过氧化氢酶和脂氧化酶等活性6。毒素相关蛋白中以黑寡妇蜘蛛中发现的Latrotoxins（LTX）7最著名。它可以通过三种方式作用于细胞膜：一是它能通过钙离子依赖的方式结合突触前膜外生蛋白，激活某种信号通路，从而释放突触小泡；二是它在其作用的细胞膜形成在一种非特异性的孔道，使其允许钙离子和一些谷氨酸、乙酰胆碱等小分子量物质通过，进而引起对靶细胞的伤害；三是它可以与G蛋白藕联受体结合，并通过G蛋白信号通路促使突触小泡大量释放神经递质8。1.1.2 蜘蛛毒素的多肽类成分蜘蛛毒液中含量最丰富也是研究最多最深入的一类就是分子量在1000到10000 Da的多肽类成分，一般
14、含有3对或是4对的二硫键。目前已有成百上千种蜘蛛多肽毒素被研究，它们的主要生物学功能是能够作用于靶体细胞膜上的各种离子通道，从而实现捕食猎物和防御天敌的目的。1.2 多肽类蜘蛛毒素的研究现状通过对多肽组学的研究，在任意两种蜘蛛中没有发现有同一分子量和相同序列的多肽，也没有在任意两种蜘蛛毒液中通过基质辅助激光解析离子飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）发现到相同分子量的肽段。蜘蛛多肽毒素呈现出多样性，但是大多数的多肽类毒素却主要集中在1到6 kDa。以中国虎纹捕鸟蛛为例，其多肽毒素主要集中在3到6 kDa9。根据多肽毒素的生物学功能主要可以分为三大类：一是作用于靶细胞膜上的各种离子通道，通过
15、堵塞或强化离子流来使猎物或天敌麻痹甚至死亡。一般的多肽通常会作用于多种不同类型的离子通道，如敬钊蜘蛛毒素-V能作用Nav1.8和Kv4.310。二是作用于神经递质受体，如芋螺毒素-GI能抑制乙酰胆碱与受体竞争性结合。三是作用于酶的相关机制，如虎蛇可以分泌强烈的凝固剂、溶血素，被虎蛇咬后，除了伤口剧痛之外，从伤口附近延伸的毒素更会令足部及颈部出现痛楚，身体感到麻痹、出汗，随即开始呼吸困难及局部肢体瘫痪。而蜘蛛毒素按照功能和作用又可以分为神经毒、坏死毒和混合毒三种，其中神经毒素占三分之二以上11。蜘蛛毒素的毒素作用是通过毒素分子与靶体细胞受体的相互作用完成的，尤其是通过各种离子通道来完成的。毒素的三维核磁共振解析和蛋白结晶的X-衍射证明了蜘蛛的多肽毒素大部分是门控修饰而不是直接堵塞门孔的方式来作用于离子通道的12-13。在三维结构图上，毒素分子表面大量的疏水性的氨基酸残基所形成的疏水斑片，其周围又分布着一些带电荷氨基酸残基，这种特殊结构能与离子通道上的电压敏感元件相互作用，影响电压敏感元件的移动，从而影响离子通道的电流。1.2.1 作用于电压门控钠离子通道毒素电压门控钠通道（voltage-gated sodiu
