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1、Westernblot常见问题解决i.啥也没有原因：比较多，如果单纯一张没有任何显色的X光片，可能是一抗加成其他抗体，或者二抗种属加错了，比如兔的加成鼠的。 解决办法：仔细检查抗体是否加错，确认转膜没有问题。经验：上面的图片展示的是一点信号都没有，可能一抗，二抗加错，可能是蛋白浓度太低，上样量太少，一抗浓度过低，ECL发光液失效。另外 如果转膜出现了问题，比如膜放反了，自然是一个白片。原因：封闭不够好，一抗浓度高，洗膜时间和次数不够 解决办法：降低一抗浓度，增加洗膜时间和次数。经验：高背景可能是WB中最常见出现的问题，目的条带单一清晰，但是其他地方又弥漫性较为均一的背景（比较连续的）。其实只要
2、我们注意 操作规范，不偷工减料就很容易避免，洗膜按照规定来8min*5次或者10min*4次，不要改成5min*3次，或者10min*2次。原因：一抗非特异性与蛋白结合解决办法：更换一抗或降低一抗浓度经验：此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断那一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述 哪个条带是目的条带。当然这种情况下也有可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。4.条带中出现边缘规则的白圈原因：电转中膜和胶之间存在气泡。 解决办法：转膜前去掉膜和胶之间的气泡 经验：我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不能太多也不能太少，最好的高度是与放上第一层滤纸
3、齐平，然后往滤纸上浇点转膜液， 把电泳胶用清水清洗下，将电泳胶平铺到滤纸上，仔细检查滤纸与胶之间是否有气泡，可以左右前后观察，不同方向观察之后确认无气泡，然后 再往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜的两侧，使膜成U型，然后将U型的底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜， 这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，然后盖上海绵。注意不要来回赶气泡，这样反而会带入气泡。5.条带中间出现白色（反白）原因：中心部位高浓度HRP把底物消耗过快，中间部位底物消耗结束之后就不发光了解决办法：降低蛋白量，降低一抗和二抗的浓度。经验：如果你足够迅速，可以在中间
4、部位底物消耗之前就把X光片给定影出来，但是时间很难把握，建议还是从降低蛋白量，降低一抗二抗浓度 入手。6.出现黑点和黑斑原因：膜上其他部位与一抗或者二抗非特异性结合解决办法：封闭牛奶一定要纯，封闭结束之后要洗经验：我们常常是等到要封闭的时候发现没有牛奶，然后匆匆忙忙用PBST/TBST配置，配的匆忙的时候往往不管是否已经完全溶解，如果没有完全溶解的情况下加牛奶倒膜上，会导致很多不溶性颗粒附着在膜上，这就会导致发光时候膜上的黑点。所以牛奶溶解之后，最好静止一下，然后 轻轻地吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束之后一定要洗三遍之后再加一抗。原因：蛋白量太大，一抗浓度和时间太长 解决办法：根据情况调整蛋白
5、量，同时一抗浓度和时间也可以缩短。 经验：这种情况很容易出现，因为很多原因都可能导致这一个结果。一般来说，蛋白量都是我们经过很多次摸索得出的最适蛋白量，因此不太可 能是蛋白量过多引起的。最有可能的是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议5min*5次，不 要但是洗这么多次就把抗体和蛋白洗掉了，你又不是拿刀在上面刮，真正的抗原抗体的结合是通过这种方式洗不掉的。8. 出现重影原因：荧光强度比较高，在压片时，放好之后不小心又轻微移动了一段距离解决办法：X光片放上去之后，就不要动了，即使放歪了也没关系。经验：有的时候出现重新刚好在上下位置，并且重影会相对弱一些，
6、不要误以为抗体识别了该蛋白的另外一种异构形式。原因：膜可能曾经干过解决办法：在每一步的操作过程中，都需要注意不要让膜干经验：在封闭的时候，洗一抗，二抗，以及发光的时候都时刻需要注意蛋白面不要风干，风干之后结果很可能就是这个样子。注意与高背景区别。10.某个条带变形原因：SDSPAGE胶中存在气泡或者某不溶性颗粒 解决办法：配胶过程中要小心，使用无杂质的液体。经验：很多实验室中使用的不是最新的设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年之后，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝 固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris缓冲液要注意不要有
7、杂质。11.条带呈哑铃状原因：配置胶有问题解决办法：把胶配好，不合格的胶坚决不用经验：出现哑铃最大的可能是胶没有配置好，胶凝固后不均一，不知道大家有没有出现如下的配胶情况，下图中示意拔完梳子之后的结果，如果 你拔完梳子之后出现图中下面部分的样子，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的 中间，蛋白自然被推挤到两边。12.最边缘条带弯曲原因：电泳电流不均一解决办法：换用新的电泳槽；不使用两边的两孔经验：一般我们使用的是10孔的的胶，如果你上样刚好10个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。电场不均一Jlr13. 其
8、他问题（1）蛋白分子量偏高或者偏低。可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑，或者说20KD的蛋白你用6% 的胶跑。（2）蛋白质降解。蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后会出现一些其他带，最主要特点是所有的条带比正常的都低 并且条带模糊不清晰。（3）所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。14. 电泳过程中出现现象及问题（1）整个条带呈 “” 状：凝胶冷却不均一，电泳槽老化。（2）整个条带呈“一”：凝胶左右两头没有凝固好（3）溴酚蓝拖尾：样品溶解不好。（4）纵向的纹理：上样样品中存在不溶性颗粒（5）溴酚蓝很粗：浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短，或者是浓缩胶配错（6）在分离胶中跑不动：Tris-Cl PH值不对，或者忘记加SDS。
