《微生物常规鉴定技术》由会员分享，可在线阅读，更多相关《微生物常规鉴定技术（11页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、微生物常规鉴定技术一、形态结构和培养特性观察1、微生物的形态结构观 察主要是通过染色， 在显微镜下对其形状、 大小、排列方式、 细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等） 及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性， 根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物 的目的。2、细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫 菌落（colony ）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下， 培养特征却有一定稳定性。 ，以此可以对不同微生物加以区 别鉴定。因此，微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别 中的一项重要内容。1）细菌的培
2、养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶 性还是脂溶性） 、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘 特征及迁移性等。 在液体培养中的表面生长情况 （菌膜、环） 混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情 况。（图3 8）图3 8 细菌的培养特征1.点状2圆形3.丝状4.不规 则形 5.假根状 6.纺锤状 7.扁平 8.隆起 9.凸起 10.垫状 11.脐状 1 2 .边缘整齐 13.波状 14.裂片状 15.啮蚀状 16.丝 状 17. 卷发状 18. 丝线状 19. 刺毛状 20. 串珠状 21. 疏展状22.树根状 23.假根状 24. 丝状 25.
3、串珠状 26.乳头状 27.绒 毛状 28. 树根状 29. 量杯状 30. 萝卜状 31. 漏斗状 32.囊状 33.层状34.絮状35.环状36.蹼状37.膜状 2）霉菌酵 母菌的培养特征：大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基 上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液 体培养也和细菌相似， 有均匀生长、 沉淀或在液面形成菌膜。 霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长，在条件适宜的培养基里， 菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延。霉菌的基内菌丝、气生菌 丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心，正面 和背面颜色常常不同，如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无 色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形
4、成絮状、绒毛状 和蜘蛛网状菌落。二、生理生化试验微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴 别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生 化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。 微生物检 验中常用的生化反应有：1、糖酵解试验不同微生物分解利用糖类的能力有很大差异，或能利用或不能利用，能利 用者，或产气或不产气。可用指示剂及发酵管检验。试验方法：以无菌操作，用接种针或环移取纯培养物少许，接 种于发酵液体培养基管，若为半固体培养基，则用接种针作 穿刺接种。接种后，置 36 1.0。培养，每天观察结果，检 视培养基颜色有无改变（产酸） ，小倒管中有无气泡，微小气泡
5、亦为产气阳性，若为半固体培养基，则检视沿穿刺线和 管壁及管底有无微小气泡，有时还可看出接种菌有无动力， 若有动力、培养物可呈弥散生长。 本试验主要是检查细 菌对各种糖、醇和糖苷等的发酵能力，从而进行各种细菌的 鉴别，因而每次试验，常需同时接种多管。一般常用的指示 剂为酚红、溴甲酚紫，溴百里蓝和An-drade指示剂。2、淀粉水解试验 某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉 水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。 试验方法：以 1824h 的纯培养物，涂布接种于淀粉琼脂斜 面或平板（一个平板可分区接种，试验数种培养物）或直接 移种于淀粉肉汤中， 于36 1培养2448h ,或于20培养
6、 5 天。然后将碘试剂直接滴浸于培养表面， 若为液体培养物， 则加数滴碘试剂于试管中。立即检视结果，阳性反应（淀粉 被分解）为琼脂培养基呈深蓝色、菌落或培养物周围出现无 色透明环、或肉汤颜色无变化。阴性反应则无透明环或肉汤 呈深蓝色。 淀粉水解系逐步进行的过程，因而试验结果 与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间，培养基含有淀粉量和 pH 等均有一定关系。培养基 pH 必须为中性或微酸性，以 pH7.2 最适。淀粉琼脂平板不宜保存于冰箱，因而以临用时 制备为妥。3、 V-P试验某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰 甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为
7、二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP( +)反应。 试验方法：1) O Meaa氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36 1培养48h，培养液1ml力口 O Meara 试剂(加有 0.3% 肌酸 Creatine 或肌酸酐 Creatinine 的 40% 氢氧化钠水溶液) 1ml ，摇动试管 12min ，静置于室温或 36 1恒温箱，若4h内不呈现伊红、即判定为阴性。亦有 主张在4850 C水浴放置2h后判定结果者。2) Barritt氏法：将试验菌接种于通用培养基，于36 1C培养4天、培养液2.5ml先加入5 Co萘酚(2-na-phthol )纯酒精溶液 0.6ml,
8、 再加 40% 氢氧化钾水溶液 0.2ml ，摇动 25min ，阳性 菌常立即呈现红色，若无红色出现，静置于室温或36 1C恒温箱，如2h内仍不显现红色、可判定为阴性。3)快速法：将 0.5%肌酸溶液 2 滴放于小试管中、挑取产酸反 应的三糖铁琼脂斜面培养物一接种环，乳化接种于其中，加 入 5%o -萘酚 3 滴， 40%氢氧化钠水溶液 2 滴，振动后放置 5min ，判定结果。不产酸的培养物不能使用。本试验一般用于肠杆菌科各菌属的鉴别。在用于芽胞杆菌和葡萄球菌 等其它细菌时，通用培养基中的磷酸盐可阻碍乙酰甲基醇的 产生，故应省去或以氯化钠代替。4、甲基红(Methyl Red )试验肠杆菌
9、科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中 产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH 值下降至 pH4.5 以下，使甲基红指示剂变红。 试验 方法：挑取新的待试纯培养物少许，接种于通用培养基，培 养于36 1或30 C（以30C较好）35天，从第二天起， 每日取培养液 1 ml ，加甲基红指示剂 12 滴，阳性呈鲜红色， 弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第 5 天仍 为阴性、即可判定结果。 甲基红为酸性指示剂， pH 范 围为 4.46.0 ，其 pK 值为 5.0 。故在 pH5.0 以下，随酸度而 增强黄色，在
10、 pH5.0 以上，则随碱度而增强黄色，在 pH5.0 或上下接近时，可能变色不够明显，此时应延长培养时间， 重复试验。5、靛基质（Imdole ）试验某些细菌能分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚。吲哚的存在可用显色反应表 现出来。吲哚与对二甲基氨基苯醛结合，形成玫瑰吲哚，为 红色化合物。试验方法：将待试纯培养物小量接种于试验培养基管，于36 1C培养24h时后，取约2ml培养液， 加入 Kovacs 氏试剂 23 滴，轻摇试管，呈红色为阳性，或 先加少量乙醚或二甲苯，摇动试管以提取和浓缩靛基质，待 其浮于培养液表面后，再沿试管壁徐缓加入 Kovacs 氏试剂 数滴，在接触面呈红色，即为阳性。实验
11、证明靛基质试剂可与 17 种不的靛基质化合物作用而产生阳性反应，若先 用二甲苯或乙醚等进行提取，再加试剂，则只有靛基质或 5- 甲基靛基质在溶剂中呈现红色，因而结果更为可靠。6、硝酸盐（ Nitrate ）还原试验有些细菌具有还原硝酸盐的能力，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐、氨或氮气等。亚硝酸盐的 存在可用硝酸试剂检验。试验方法：临试前将试剂的 A（磺胺酸冰醋酸溶液）和B （a萘胺乙醇溶液）试液各0.2ml 等量混合、取混合试剂约 0.1ml 、加于液体培养物或琼脂斜 面培养物表面，立即或于 10min 内呈现红色即为试验阳性， 若无红色出现则为阴性。用a-萘胺进行试验时，阳性红色消退很快、故加入后
12、应立即判定结果。进行试验时必须有 未接种的培养基管作为阴性对照。a -萘胺具有致癌性、故使 用时应加注意。7、明胶（Gelatin ）液化试验有些细菌具有明胶酶 （亦称类蛋白水解酶） ，能将明胶先水解为多肽， 又进一步水解为氨基酸，失去凝胶性质而液化。试验方法：挑取 1824h 待试菌培养物，以较大量穿刺接种于明胶 高层约2/3深度或点种于平板培养基。 于2022 C培养714 天。明胶高层亦可培养于 36 1C。每天观察结果，若因培 养温度高而使明胶本身液化时应不加摇动、静置冰箱中待其 凝固后、再观察其是否被细菌液化，如确被液化，即为试验 阳性。平板试验结果的观察为在培养基平板点种的菌落上滴
13、 加试剂，若为阳性， 1020min 后，菌落周围应出现清晰带 环。否则为阴性。8、尿素酶（Urease ）试验有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生 2 个分子的氨，使培养基 变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底 物尿素是否存在， 细菌均能合成此酶。 其活性最适 pH 为 7.0 。 试验方法：挑取 1824h 待试菌培养物大量接种于液体培养 基管中，摇均，于 36 1C培养10, 60和120min，分别观 察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部，留 底部作变色对照。培养 2， 4 和 24h 分别观察结果，如阴性 应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。
14、9、 氧化酶（ Oxidase ）试验 氧化酶亦即细胞色素氧化酶， 为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素 C 氧化，然后此氧化型细胞色素 C 再使对苯二胺氧化，产生 颜色反应。 试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平 板菌落上滴加试剂 12 滴，阳性者 Kovacs 氏试剂呈粉红色 深紫色， Ewing 氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。10、硫化氢（H2S ）试验 有 些细菌可分解培养基中含硫氨基酸或含硫化合物，而产生硫 化氢气体，硫化氢遇铅盐或低铁盐可生成黑色沉淀物。 试验方法：在含有硫代硫酸钠等指示剂的培养基中，沿管壁 穿刺接种，于36 1C培
15、养2428h，培养基呈黑色为阳性。 阴性应继续培养至 6 天。也可用醋酸铅纸条法：将待试菌接 种于一般营养肉汤，再将醋酸铅纸条悬挂于培养基上空，以 不会被溅湿为适度；用管塞压住置36 1 C培养16天。纸条变黑为阳性。11、三糖铁（TSI ）琼脂试验试验方法： 以接种针挑取待试菌可疑菌落或纯培养物，穿刺接种并涂布于斜面，置36 1C培养1824h，观察结果。本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄） ；产生硫 化氢（变黑） 。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量 少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养 基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部 由于是在厌氧
16、状态下， 酸类不被氧化， 所以仍保持黄色。 12、 硫化氢-靛基质-动力（SIM ）琼脂试验试验方法：以接种针挑取菌落或纯养物穿刺接种约1/2深度，置36 1C培养1824h ，观察结果。 培养物呈现黑色为硫化氢阳性， 混浊或 沿穿刺线向外生长为有动力，然后加 Kovacs 氏试剂数滴于 培养表面，静置 10min ，若试剂呈红色为靛基质阳性。培养 基未接种的下部，可作为对照。本试验用于肠杆菌科细菌初步生化筛选，与三糖铁琼脂等联合使用可显著提高筛选 功效。三、血清学试验 血清学反应是指：相应的抗原与 抗体在体外一定条件下作用，可出现肉眼可见的沉淀、凝集 现象。在食品微生物检验中，常用血清学反应来鉴定分离到 的细菌， 以最终确认检测结果。血清学反应的
