肝脏持续过表达IL-15对NK/NKT细胞和T细胞数目和活化状态的影响殷文伟，童师雯，刘俊英,张琼方，胡怀东(4000l6重庆，重庆医科大学病毒性肝炎研究所、重庆医科大学附属第二医院)[摘要] 目的 研究靶向肝脏过表达细胞因子IL-15对机体免疫系统的影响方法 构建IL-15重组表达质粒pLIVE-IL-15,采用高压注射的方式尾静脉注射C57BL/6小鼠，ELISA检测小鼠血清中IL-15的表达水平,流式检测小鼠脾脏和肝脏淋巴细胞亚群变化结果 成功构建pLIVE-IL-15质粒，pLIVE-IL-15质粒高压注射小鼠后血清中能检测到IL-15持续表达与pLIVE-EGFP对照组相比，pLIVE-IL-15质粒注射鼠天然免疫系统NK细胞和NKT细胞以及获得性免疫系统的CD4+T细胞和CD8+T细胞数目均显著增加（P<0.05）体内过表达IL-15促进NK细胞高表达CD69和IFN-γ而NKT细胞活化状态改变不明显，IL-15能显著诱导CD8+T细胞高分泌IFN-γ（P<0.05）而对CD4+T细胞IFN-γ分泌影响较小结论 pLIVE-IL-15靶向肝脏后能在体内持续表达，并且能调节天然免疫系统和获得性免疫系统反应。
[关键词] IL-15；免疫系统；高压注射[中图法分类号] R735.7；R-331 [文献标志码]AA study of the effect of persistent IL-15 expression in liver on the number and activation state of NK/NKT cells and T cellsYin Wenwei, Tong shiwen, Lin junying, Zhang qiongfang, Hu huaidong （Institute for Viral Hepatitis，Chongqing Medical University; the Second Affiliated Hospital of Chongqing University of Medical Sciences , Chongqing, 400016，China）[Abstract] Objective To study the effect of persistent IL-15 expression in liver on immune system. Methods IL-15 expression plasmid pLIVE-IL-15 was constructed and delivered into the mouse liver by hydrodynamic injection; Serum IL-15 was detected by ELISA. Spleen and Liver lymphocytes were analyzed by FACS. Results p-LIVE-IL-15 plasmid was successfully constructed and administration of pLIVE-IL-15 resulted in a persistent expression of IL-15. Compared with pLIVE-EGFP group, pLIVE-IL-15 treatment increased the number of innate immune cells (NK cell and NKT cell) and acquired immune cells (CD4+T cell and CD8+T cell) significantly （P<0.05）.Over-expression of IL-15 in vivo enhanced the expression of CD69 and IFN-γ by NK cells but did not affect the activation status of NKT cells. IL-15 can dramatically stimulate IFN-γproduction by CD8+Tcells（P<0.05）and intracellular expression of IFN-γby CD4+T cells was only slightly enhanced in IL-15 treated mice.Conclusion Hydrodynamic injection of the plasmid pLIVE-IL-15 resulted in sustained high level of IL-15 in mouse serum and modulated the immune response of innate and acquired immune cells. So, this study may provide an implication in gene therapy and immune therapy.[Key words] IL-15, immune system, hydrodynamic injectionSupported by the National Natural Science Foundation of China（81171560）. Corresponding author: Hu Huaidong，E-mail：hhd0126@163com [基金项目] 国家自然科学基金面上项目（81171560）[通信作者]胡怀东， E-mai:hhd0126@ 细胞因子是免疫系统中一类重要的调节因子，具有广泛的免疫调节效应，可用于肿瘤和感染性疾病的免疫治疗。
在以往的研究中，人们大多采用对机体注射重组细胞因子的方法来研究细胞因子的免疫学活性或者进行免疫治疗研究，但是这通常需要很多的重组蛋白，比较昂贵且需要多次重复注射近年来，人们采用高压注射包含细胞因子基因序列的重组质粒实现了小鼠在体表达细胞因子[1-2]，但表达时间较短，不能实现在体内持续过表达细胞因子，限制了其长期免疫治疗调节研究IL-15是一种多能的细胞因子，对免疫系统的天然免疫细胞和获得性免疫细胞都具有重要调节作用[3-4]已有研究表明，IL-15在骨髓移植[5]、肿瘤免疫治疗[6]、抗HIV感染过程中均发挥重要的免疫调节作用[3, 7]肿瘤、骨髓移植和HIV感染都是属于慢性疾病，需要长期重复注射IL-15来维持IL-15免疫调节效应，因此，探索体内长期持续表达IL-15的方法对于IL-15用于免疫治疗具有重要意义本研究通过构建pLIVE-IL-15质粒，尾静脉高压注射小鼠，实现了在体内持续高表达IL-15，并观察其对机体免疫系统的影响，以期为今后临床免疫治疗提供实验依据1材料与方法1.1 材料pLIVE vectors从Mirus公司购买，pLIVE-EGFP质粒由本室构建IL-15基因表达序列由Barbara K.Felber教授(National Cancer Institute-Frederick,Frederick,Maryland,USA)馈赠。
IL-15 ELISA检测试剂盒购于武汉华美公司DNA重组相关试剂Pfu DNA Taq（2.5 U/µL），BamHⅠ (10 U/µL), AscⅠ (10 U/µL), Rapid DNA ligation Kit 均为Fermentas公司产品AxyGen公司小抽质粒试剂盒Promega公司胶回收试剂盒流式抗体:FITC-anti-CD4, APC-anti-CD8α, FITC-anti-CD69, PE-anti-NK1.1, PE-anti-IFN-γ, PerCP/CY5.5-anti-CD3, PE/CY7-anti-NK1.1, FITC Armenian Hamster IgG1.λ3 isotype control, PE Rat immunoglobulin G1.κ (IgG1) isotype control，所有抗体均订购于BD Bioscience公司1.2 pLIVE-IL-15质粒构建IL-15基因在体内表达受到多方面调控，简单将IL-15基因表达框克隆到载体中进行体内表达，检测不到IL-15蛋白的产生Barbara K. Felber教授 (National Cancer Institute-Frederick, Frederick, Maryland, USA) 实验室对IL-15基因表达框进行了优化调整[8]，将小鼠IL-15基因的前导肽区序列换成了小鼠GM-CSF的前导肽区序列，并对IL-15的基因序列作了同义突变，实现了IL-15在体内的过表达。
前期研究表明通过对小鼠高压注射包含IL-15目的基因的载体可以实现在体内表达IL-15[8]，不过，IL-15在体内的表达是短暂的（只能持续3天）我们利用pLIVE-vector质粒能实现目的基因持续表达的特点，将经过优化的IL-15基因表达框克隆插入到pLIVE-vector载体中我们设计了分别含ASCⅠ和BamHⅠ酶切位点的引物，AscI P1: 5´-AGGCGCGCCATGTGGCTCCAGAACCTGC-3´, BamHI P2: 5´-CGAGGATCCTTATCACGACGTGTTGATG-3´,斜体代表内切酶识别位点再通过PCR的方法 从Barbara K. Felber教授提供的载体中扩增出IL-15目的基因对PCR产物和pLIVE-载体双酶切，接着进行连接，转化等步骤将优化的IL-15表达框插入到pLIVE载体中送样测序鉴定pLIVE-IL-15质粒是否构建成功1.3 pLIVE-IL-15质粒高压注射将10 µg pLIVE-EGFP/pLIVE-IL-15质粒溶于2ml PBS溶液，通过尾静脉高压注射C57BL/6鼠（C57BL/6鼠，SPF级，雄性，6～8周龄，体质量18～23 g，购于中国科学院上海斯莱克实验动物中心。
实验操作按重庆医科大学实验动物条例执行），在不同的时间点收集血清用于检测血清中IL-15含量1.4 脾脏和肝脏单个核细胞分离及流式检测小鼠摘眼球放血后脱臼处死, 摘取脾脏，200目筛网研磨过滤，转移至15 mL离心管中，750 ×g 10 min离心收集细胞；1 mL RBC裂解液冰浴裂解红细胞2 min后，10 mL PBS溶液终止裂解反应；750×g 10 min离心收集细胞，PBS溶液洗1次，即得到脾脏单个核细胞小鼠摘眼球放血后脱臼处死, 摘取肝脏剪碎肝脏组织，200 目筛网研磨过滤，转至50 mL离心管中；50×g 1 min，吸取上层液体，750×g 10 min 离心后弃上清；2 mL 40% Percoll 溶液重悬沉淀，轻加于2 mL 70% Percoll 溶液，1 260×g 20 min离心，升6降2，后吸取2层Percoll溶液界面的白细胞层；吸取细胞层至15 mL离心管中，加PBS溶液约满管后1 260×g 10 min离心收集细胞，PBS溶液洗1次，收集得到的细胞即为肝脏单个核细胞封闭：10μL大鼠血清4℃封闭20 min；抗体标记：取适量待测的荧光标记抗体，4℃避光标记30 min后,PBS溶液洗1次；检测与分析：200～300μL PBS溶液重悬标记后的细胞，流式细胞仪仪器检测, WinMDI 2.8软件分析所得数据1.5 数据分析采用SPSS13.0统计学软件对实验数据进行单因素方差分析。
2结果1.6 2.1 pLIVE-IL-15质粒构建PCR方法鉴定构建的pLIVE-IL-15载。