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1、联系个人所学专业，选取某种或某类疾病,设计相关实验的动物模型,详细描述其 方法及步骤，并阐述所选动物种类和级别的理由以及该动物日常生活和实验的环 境要求(包括进出该环境的顺序)，实验过程中的注意事项MicroRNA378 (miR378)在心肌肥厚中的研究一、实验原理:microRNA (miRNA)是一类小分子非编码单链RNA,长约22个碱基，能通过与 靶mRNA3非翻译区(3UTR)互补配对，使其翻译受到抑制，从而在转录后水平 对生物体内基因时序性表达起到精细调节作用。miRNA的表达变化与心肌肥厚 的发生、发展密切相关。本实验通过异丙肾上腺素和去甲肾上腺素诱导实验动物 心肌肥厚，然后用P
2、CR技术测定心肌细胞中miRNA的变化。二、实验目的：通过统计学方法观察miRNA在正常心肌细胞和心肌肥厚的心肌细胞中的差异， 从而将miRNA作为诊断心肌肥厚的潜在的生物学标志。三、实验材料及步骤：Wistar雄性大鼠30只(200250g/只，SPF级别)，异丙 肾上腺素(ISO),去甲肾上腺素(NE),生理盐水。3.1 分组及造模3.1.1采用随机数表的方法讲30只wistar大鼠随机分成三组，每组10只,分别为 对照组、 ISO 处理组、 NE 组。3.1.2ISO处理组：10只大鼠连续7天背部皮下注射ISO ( 4 mg/kg/天)，制成心 肌肥厚模型。NE处理组：10只大鼠连续7天
3、背部皮下注射NE ( 4 mg/kg/天)，制成心肌肥厚 模型.对照组：10只大鼠同法背部皮下注射生理盐水(4 mg/kg/天),制成心肌肥厚模型。 3。 2 检测造模是否成功3.2。 1 高频超声检测分别于造模后第 2 周，称取大鼠质量， 10水合氯醛麻醉大鼠后,仰卧固定，将 其胸前部剃毛，应用TOSHIBA-6000超声诊断仪,频率为7。5 MHz的探头置于 其胸左侧，取径(LVEDD,LVESD)。左室射血分数(EF，% )、左室短轴缩短率(FS，%)、计算左室左室长轴切面,图像深度调至3.0 cm，由二维超声引导，将 M型超声取样线置于二尖瓣腱索水平，垂直于室间隔及左室后壁，经M型超声
4、 曲线进行测量，每一超声测定值取 3 个连续心动周期测量均值。超声测量指标: 舒张末期及收缩末期室间隔厚度(IVSTd,IVSVTs)、舒张末期及收缩末期左室后壁 厚度(LVPWTd, LVPWTs)、舒张末期及收缩末期左室内质量(LVM,mg). 3。 2.2 大鼠心肌质量指数的测定称取大鼠体质量(body weight, BW)，摘眼球取血备用，脱颈椎处死，快速打开 胸腔取心脏，去除心房组织，分离左、右心室,生理盐水漂洗去血，用滤纸吸干 表面水分，电子天平准确称取左心室质量(left ventricle weight, LVW)和全心质 量(heart weight, HW)。计算左心室质
5、量与体质量的比值(LVW/BW)、全心质量 与体质量的比值(HW/BW)，分别记为左心室质量指数(left ventricular weight index ， LVWI)和全心质量指数(heart weight index, HWI).3。 2.3 心肌细胞横断面面积测定每组随机取 3 只大鼠,取左心室中段， 10福尔马林液固定的心肌组织经乙醇梯 度脱水、透明、浸蜡包埋后，切成5 pm的切片，将左心室心肌进行HE染色， 选择横断心肌的切片（细胞核清晰，细胞膜完整）放大400倍。用Image Pro Plus 4.0图像分析软件，测量左心室心肌细胞横断面面积。每一标本随机测量20个心 肌细胞，
6、计算其细胞平均横断面面积。3。3测量miR-378水平3。3。1 RNA提取：用RNA提取试剂盒提取各组大鼠先前在3.2。2中备用的血 中的RNA，一切步骤按照试剂盒说明书。3.3。2逆转录：将提取的RNA作为模板加入到20plPCR体系中，在一定的反应 条件下反应成cDNA。3。3。3miR378水平的检测：将3。3。2中反应的cDNA作为模板在20plPCR 体系中，在一定的反应条件下进行实时荧光定量PCR反应。3.3.4用统计学方法比较观察处理组与对照组之间miR-378水平差异.五、选择SPF级别Wistar雄性大鼠的理由：现已遍及世界各国的实验室，价格便宜易得.10周龄时雄性大鼠体重
7、可达280300g，性情温顺.对传染病的抵抗力较强.自发性肿瘤发生率低。大鼠是研究心血管疾病的首选动物.SPF 动物（specific pathogen free animal）即无特定病原体动物，指除清洁动物应排除的病原外，不携带重要潜在感染或条 件致病和对科学实验干扰大的病原。饲养在屏障系统中，是通过无菌动物、悉生 动物而获得的。笼具、饲料饮水都要经过特殊处理，并有严格的检疫、消毒、隔 离制度所以科研实验主要使用SPF动物。六、Wistar大鼠日常生活：昼伏夜动2、喜独居3、胆小怕惊4、喜啃咬5、抗病力较强6、敏感性强七、SPF级动物实验室实验要求：温度：1829度，相对湿度：50%80%
8、12h昼12h夜。1。从事SPF级实验大、小鼠的饲养管理工作的饲养员必须经过有关专业培训, 持证上岗。2每次进入屏障环境前，须用塑料桶内配制消毒液，并消毒液擦拭桶壁后，紫外 照射20分钟后待用.3. 饲养人员在进入屏障环境前，应在外更衣室脱去外衣，除下手表、手机、饰品等 物品,换拖鞋，洗手（眼镜）。后进入内更衣室，穿戴净化衣、帽、口罩、手套，换 拖鞋。拉开风淋室外门，人员进入后，立即关闭外门，风淋自动启动1分钟（已 设置），进入清洁走廊。4。饲养人员先从清洁储藏室把动物用的笼具、饲料、饮用水等物品经清洁走道 分配至各区域的饲养室.5小鼠饲养笼具的更换周期至少2次/周，饲养人员应逐间更换饲养室的
9、饲养笼、 饮水瓶，添加饲料，每次更换下来的笼具、饮水瓶等物品通过污物走廊运至缓冲 间，然后，擦拭笼架、地面、侧壁及门把等，检查饮水瓶有无漏水，喷雾消毒饲养室， 再进入另一间饲养室同样操作。6. 饲养人员在工作中如发现有死亡动物时，应立即取出动物尸体，用塑料袋包装， 记录笼号、动物死亡数、日期，并更换该鼠笼、笼盖、饲料及饮水瓶，把更换下 来的物品及动物尸体一起送至污物走廊前端的缓冲间.7。每月第一周周三更换各饲养室的排风口滤材，消毒擦拭顶壁、进风口及灯具 罩。8. 每批动物实验结束后,应把该批动物的笼器具拿出屏障环境清洗,高压灭菌后再 使用。9。每次更换笼具工作结束后，饲养人员应检查各饲养室的门
10、是否全部关闭，拖 拭清洁走道、清洁储藏室、缓冲间、更衣室、次清洁走道的地面，然后走出屏障 环境外。10。在确认屏障环境内无人员后，开启紫外灯，照射 20分钟。八、进出该环境的顺序 人员：更衣淋浴更衣清洁走廊饲养室或动物实验室污染走廊洗刷消 毒室-更衣-外部区域.物品:包装高压消毒（已包装消毒的可经传递窗,清结笼具经有消毒液的渡槽） 清结准备室清洁物品储存室饲养室或动物实验室（污物经包装处理 ）污 染走廊外部区域。动物：动物（带专用包装）传递窗检疫室清洁走廊饲育室或实验室（实 验后或生产供应）（经包装）污染走廊外部区域。九、注意事项：1。防止病原菌的污染，要严格按照 SPF 级实验室规定操作.2。注意观察实验室 的环境条件，保持环境温度,湿度等在规定的条件下。3。注意观察动物的活动状 况,观察有无生病或死亡的。
