《细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法》由会员分享，可在线阅读，更多相关《细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法（21页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测方法The document was prepared on January 2, 2021细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测方法一、定性和定量研究只定性的研究方法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶 电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进行定量或半定量的研 究方法：各种流式细胞仪方法、原位末端标记法、ELISA定量琼脂糖凝胶电泳。二、区分凋亡和坏死可将二者区分开的方法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜 是是区分凋亡和坏死最可靠的方法），Hoechst33342/PI双染色法流式细胞仪检测， AnnexinV/PI双染色法流式细胞
2、仪检测等。不能将二者区分开的方法：原位末端标记 法、PI单染色法流式细胞仪检测等。三、样品来源不同选择组织：主要用形态学方法（HE染色，透射电镜、石蜡包埋组织切 片进行原位末端标记，ELISA或将组织碾碎消化做琼脂糖凝胶电泳）。四、细胞凋亡检测1、早期检测：1）PS（磷脂酰丝氨酸）在细胞外膜上的检测2）细胞内氧化还原状态改变的检测3）细胞色素C的定位检测4）线粒体膜电位变化的检测2、晚期检测：细胞凋亡晚期中，核酸内切酶在核小体之间剪切核DNA，产生大量长度在180-200 bp 的DNA片段。对于晚期检测通常有以下方法：1）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）2）LM-
3、PCR Ladder （连接介导的PCR检测）3）Telemerase Detection （端粒酶检测）3、生化检测：1）典型的生化特征：DNA片段化2）检测方法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL （末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA片段 的3-OH端，再通过酶联显色或荧光检测定量分析结果。可做细胞悬液、福尔马林固定 或石蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。4、LM-PCR Ladder （连接介导的 PCR检测）当凋亡细胞比例较小以及检测样品量很少（如活体组织
4、切片）时，直接琼脂 糖电泳可能观察不到核DNA的变化。通过LM-PCR,连上特异性接头，专一性地扩增梯 度片段，从而灵敏地检测凋亡时产生梯度片段。此外，LM-PCR检测是半定量的，因此 相同凋亡程度的不同样品可进行比较。如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，用 32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进行电泳和放射自 显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。上述两种方法都针对细胞凋亡晚期核DNA 断裂这一特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产生这一现象，因 此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的干扰。需结合其它的方法来检测细胞凋亡。其 它方法
5、：1）Telemerase Detection （端粒酶检测）端粒酶是由RNA和蛋白组成，它可以 自身RNA为模板逆转录合成端粒区重复序列，使细胞获得“永生化”。正常体细胞是没有 端粒酶活性的，每分裂一次，染色体的端粒会缩短，这可能作为有丝分裂的一种时钟，表明细胞年龄、复制衰老或细胞凋亡的信号。研究发现，90%以上的癌细胞或凋亡细胞 都具有端粒酶的活性。2）mRNA水平的检测研究者们发现了很多在细胞凋亡时表达异 常的基因，检测这些特异基因的表达水平也成为检测细胞凋亡的一种常用方法。据报 道，Fas蛋白结合受体后能诱导癌细胞中的细胞毒性T细胞（cytotoxic T cells）等靶细 胞。Bc
6、l-2和bcl-X （长的）作为抗凋亡（bcl-2和bcl-X）的调节物，它们的表达水平比 例决定了细胞是凋亡还是存活。用荧光定量PCR技术来检测基因表达水平无疑比之前 者更快更准确。通过检测fas, bax-alpha和bcl-X （长的）基因的mRNA表达水平来进行 细胞凋亡的检测。5、细胞内氧化还原状态改变的检测：正常状态下，谷光苷肽（GSH）作 为细胞的一种重要的氧化还原缓冲剂。细胞内有毒的氧化物通过被GSH还原而定期去 除，氧化型的GSH又可被GSH还原酶迅速还原。这一反应在线粒体中尤为重要，许 多呼吸作用中副产物的氧化损伤将由此被去除。当细胞内GSH的排除非常活跃时，细 胞液就由还
7、原环境转为氧化环境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从 而使细胞色素C （三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效 应器caspase的级联反应。6、细胞色素C的定位检测细胞色素C作为一种信号物 质，在细胞凋亡中发挥着重要的作用。正常情况下，它存在于线粒体内膜和外膜之间的 腔中，凋亡信号刺激使其从线粒体释放至细胞浆，结合Apaf-1 （apoptotic protease activating factor-1）后启动caspase级联反应：细胞色素C/Apaf-1复合物激活 caspase-9，后者再激活caspase-3和其它下游caspase。7、线粒体膜
8、电位变化的检 测:1）线粒体跨膜电位的耗散与细胞凋亡有密切关系2）近年来陆续有报道说明线粒 体跨膜电位的耗散早于核酸酶的激活，也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面。而一旦线 粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡过程。3）在细胞凋亡过程中线粒体跨 膜电位的耗散主要是由于线粒体内膜的通透性转变，这是由于生成了动态的由多个蛋白 质组成的位于线粒体内膜与外膜接触位点的通透性转变孔道（PT孔道）能稳定线粒体跨膜 电位就能防止细胞凋亡。线粒体在细胞凋亡作用中的进一步证据:1）若将纯化的正常 的线粒体与纯化的细胞核在一起保温，并不导致细胞核的变化。但若将诱导生成PT孔 道的线粒体与纯化的细胞核一同保温，细
9、胞核即开始凋亡变化。2）形态学观察，看到 细胞数目有限，统计学上的准确性受影响；3）凝胶电泳检测DNA破坏了细胞的完整性 也不能测出凋亡细胞占总细胞的比例；4）流式细胞术可检测细胞、亚细胞及分子水平 的特征性变化。用于流式细胞仪检测的染料：PI、Hoechst、EB、DAPI、Y橙等， 其中 PI、Hoechst 最常用。PI 和 Hoechst33342双标：PI、Hoechst33342均可与细胞 核DNA （或RNA）结合。但是PI不能通过正常的细胞膜，Hoechst则为膜通透性的荧 光染料，故细胞在处于坏死或晚期调亡时细胞膜被破坏，这时可为PI着红色。正常细 胞和中早期调亡细胞均可被H
10、oechst着色，但是正常细胞核的Hoechst着色的形态呈 圆形，淡兰色，内有较深的兰色颗粒；而调亡细胞的核由于浓集而呈亮兰色，或核呈分 叶，碎片状，边集。故PI着色为坏死细胞；亮兰色，或核呈分叶状，边集的Hoechst 着色的为调亡细胞。PI和Annexin-V双标：磷脂酰丝氨酸（PS）正常位于细胞膜的内 侧，但在细胞凋亡的早期（或细胞损伤时）PS可从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表 面，暴露在细胞外环境中。Annexin-V（green）可以和磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结 合。因此细胞处于调亡或坏死时，Annexin-V可为阳性（早期的坏死细胞可能为阴 性）。但是只有坏死的细胞PI是阳性五、
11、形态学观察1、普通光学显微镜观察 2、透射电子显微镜观察3、荧光显微镜观察1、普通光镜下观察：1）用苏木素-伊红（HE）染色：细胞核固缩碎裂、呈蓝黑色、胞浆呈淡红色（凋亡细 胞），正常细胞核呈均匀淡蓝色或蓝色，坏死细胞核呈很淡的蓝色或蓝色消失2）Giemsa染色法、瑞氏染色法等，正常细胞核的色泽均一，凋亡细胞染色变深，坏死 细胞染色浅或没染上颜色直接用倒置显微镜观察：1）细胞体积变小，全面皱缩；2）凋亡小体为数个圆形小体围绕在细胞周围。2、透射电子显微镜观察凋亡细胞体积变小，细胞质浓缩。细胞凋亡过程中细胞核染色质的形态学改变分为三期：1期的细胞核呈波纹状或呈折缝 样，部分染色质出现浓缩状态；l
12、la期细胞核的染色质高度凝聚、边缘化；llb期的细 胞核裂解为碎块，产生凋亡小体。3、荧光显微镜常用的荧光染料：丫啶橙、PI、 DAPI、Hoechst33258 和 Hoechst33342、EB 等 Hoechst 33342、Hoechst 33258、 DAPI三种染料与DNA的结合是非嵌入式的，主要结合在DNA的A-T碱基区。紫外光 激发时发射明亮的蓝色荧光。1） PI双染色法基本原理Hoechst是与DNA特异结合的 活性染料，能进入正常细胞膜而对细胞没有太大得细胞毒作用。Hoechst 33342在凋亡 细胞中的荧光强度要比正常细胞中要高。DAPI为半通透性，用于常规固定细胞的染
13、 色。碘化丙啶（PI ）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但在凋亡中晚期的细胞 和死细胞，PI能够透过细胞膜而将细胞核染红。因此将Annexin-V与PI匹配使用，就 可以将凋亡早晚期的细胞以及死细胞区分开来。注意事项：细胞凋亡时，其DNA可染 性降低被认为是凋亡细胞的标志之一，但这种DNA可染性降低也可能是因为DNA含量 的降低，或者是因为DNA结构的改变使其与染料结合的能力发生改变所致。在分析结 果时应该注意。六、细胞凋亡的分子生物学检测方法：细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程，染色体DNA首先在内源性的 核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后大约30
14、 %的染色体DNA在Ca 2+和Mg2+依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180200bp 核小体DNA多聚体。DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的 3-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧 光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3-末端，从而 可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端 标记法（TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3- OH形成，很少能够被染色。低分子量的DNA分离后，也可使用DNA聚合酶进行缺口 翻
15、译（nick translation），使低分子量的DNA标记或染色，然后分析凋亡细胞。TUNEL或缺口翻译法实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个 凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确的反应细胞凋亡最典型的生物化学和形态 特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的 细胞凋亡测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，灵敏度远比一般的组织化学和生物化学 测定法要高，因而在细胞凋亡的研究中已被广泛采用。过氧化物酶标记测定法原理：脱氧核糖核苷酸衍生物地高辛（digoxigenin） -11-dUTP在 TdT酶的作用下，可 以掺入到凋亡细胞双链或单链D
16、NA的3-OH末端，与dATP形成异多聚体，并可与连 接了报告酶（过氧化物酶或碱性磷酸酶）的抗地高辛抗体结合。在适合底物存在下，过 氧化物酶可产生很强的颜色反应，特异准确的定位出正在凋亡的细胞，因而可在普通光 学显微镜下进行观察。毛地黄植物是地高辛的唯一来源。在所有动物组织中几乎不存在能与抗地高辛杭体结合 的配体，因而非特异性反应很低。抗地高辛的特异性抗体与脊椎动物甾体激素的交叉反 应不到1 %,若此抗体的Fc部分通过蛋白酶水解的方法除去后，则可完全排除细胞Fc 受体非特异性的吸附作用。本方法可以用于福尔马林固定的石蜡包埋的组织切片、冰冻切片和培养的或从组织中分 离的细胞凋亡测定。（一）试剂配制1、磷酸缓冲液PBS （）:磷酸钠盐50mM, NaCl 200mM。2、蛋白酶 K （200pg/ml,）:蛋白酶 K 0.02g ; PBS 1
