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1、实验八蛙心灌流钱涛生命科学院一、实验目的1、学习斯氏离体蛙心灌流法2、了解心肌的生理特性。3、观察 、 及肾上腺素（Adr）、乙酰胆碱（ACh）对离体心脏活动的影响。二、实验原理维持心脏正常收缩的节律和强度，需要有一个适当的理化环境（离子的浓度、 比例、溶液的酸碱度、环境温度等），这种环境条件稍有改变，便可影响心脏的 正常活动。心脏的正常节律性活动必须在适宜的理化环境里才能维持，一旦适宜的理化 环境被干扰或破坏，心脏活动就会受到影响。心脏受植物性神经的双重支配，交 感神经兴奋时，其未梢释放去甲肾上腺素，使心肌收缩力加强，传导增快，心率 加快；而迷走神经兴奋时，其未梢释放乙酰胆碱，使心肌收缩力减
2、弱，心率减慢。 把离体蟾蜍心脏，即失去了神经支配的蟾蜍心脏保持在适宜的环境中，在一定时 间内其仍能产生节律性兴奋和收缩活动。这是由于蟾蜍的静脉窦能够自动按照一 定的节律产生兴奋，并传导到其他心肌细胞，从而引起整个心脏有节律地兴奋和 收缩。离体心脏灌流，是在有控制的条件下研究体液因素以及药物对心肌作用机 制的重要实验方法。两栖类动物心脏无冠状循环，心肌的血液供应直接来自心室 腔，故灌流时套管插入心室腔内，但灌流哺乳动物心脏时则须通过冠状血管。本实验是将蛙心离体后，用人工配制理化特性近似蛙血浆的任氏溶液灌流， 在一定时间内，可保持节律性收缩和舒张，如改变任氏液的组成成分或浓度，心 脏活动的强度和频
3、率将受到影响。三、动物与器材实验动物：蟾蜍4只/组。实验器材：蟾蜍解剖器械、生物/桥式前置、刺激/记录电极、蛙心插管、 万向轮、蛙心夹、线、滴管、培养皿、支架、木夹、蛙针。实验试剂：任氏液（含肝素）、0.65%NaCl溶液、2%CaCl2溶液、1%KC1溶 液、1 ： 5000去甲肾上腺素溶液、1 ： 10000乙酰胆碱溶液、阿托品溶液、1%乳 酸、2.5%NaHCO3。四、方法与步骤 一）离体蛙心制备用刺蛙针捣毁蛙的脑和脊髓，将蛙仰卧固定于蛙板上。打开胸腔，剪开心包 膜,暴露心脏。在静脉窦下方穿一线供结扎静脉备用，在主动脉干下方穿一线作 固定插管备用，在主动脉左侧分支下方穿一线结扎之。用眼科
4、镊夹住主动脉干近 根部，眼科剪于夹持处剪一斜切口，将盛有少量任氏液的蛙心插管由此切口插入 主动脉，管头插至动脉圆锥时，插管稍后退并向左侧作90旋转，在心室收缩 时向心室后壁方向下插，经主动脉瓣插入心室，可见插管内液体喷入血液并随心 室的舒缩而上下波动。用线将动脉结扎固定于插管上，并将结扎线固定于插管的 侧钩上以防插管滑出心室。轻轻提起插管将心脏抬高，于静脉窦与腔静脉交界处 结扎静脉窦下方的备用线(注意不要扎住静脉窦，以免心脏停跳)。提起插管， 在结扎线的远心端剪去所有组织，游离蛙心。用新鲜任氏液换取蛙心插管内含血 的任氏液数次，直至插管内任氏液完全清澈。将蛙心插管固定于试管夹上，用蛙 心夹在心
5、室舒张期夹住心尖。将蛙心夹上的丝线连结于张力换能器上，调节该线的张力。Au房劝關闊惟图1 蛙心插管法搭好装置，向蛙心插管内加入不同试剂进行实验:(1) 将插管内的任氏液吸出，换入4C的任氏液, 观察曲线变化，待效应明显后，吸出灌流液，换 入室温的任氏液，直至曲线恢复正常。再换用 40C任氏液实验。(2) 离子的影响 吸出插管内全部灌流液，换入0.65%NaCl 观察心缩曲线变化，待效应明显后，吸出灌流液, 用新鲜任氏液换洗3次，直至心缩曲线恢复正常。 加入12滴2%CaCl2于新换入的任氏液 中，观察心缩曲线的变化。待出现效应后，用新 鲜任氏液换洗3次至曲线恢复正常。 加12滴1%KCl于新换
6、入的任氏液中，待 出现效应后，再用任氏液换洗至曲线恢复正常。(3) 递质的作用加入12滴1:10000去甲肾上腺素于灌流 液中，待效应出现后，用任氏液换洗至曲线恢复正常。加入1滴1:10000乙酰胆碱于灌流液中，待效应出现后，用任氏液换洗至 曲线恢复正常。(4) 药物的影响加入12滴阿托品溶液于灌流液中，待效应出现后，用任氏液换洗至曲线 恢复正常。(5) 酸碱的影响 加入2.5%NaHC03溶液12滴于灌流液中，观察曲线变化，待效应明显后, 换用任氏液换洗，直至曲线恢复正常。 加3%乳酸12滴于灌流液中，观察曲线变化，待效应明显后，再加12 滴2.5%NaHC03,观察曲线变化。五、实验记录1
7、 正常D o turn gnt1zon5-i l-i iin D5：y?i.r3020-In1D30图2正常的心脏2 40C任氏液D ocum图3加入40C任氏液3 4C任氏液1- 11 hl HK 1 K州nWrI.图4加入4C任氏液分析：温度降低，使心率减慢。4 加 0. 65%NaClZI3J5-I l-l 11H 1I：55.Z3CI图 5 加入 0.65%NaCl分析：灌流液中缺乏Ca2+，使得心肌内Ca2+浓度大大减小，心肌的兴奋收缩 耦联过程减弱，心肌收缩能力减弱。5力口 KC1D oDum snt1图6加入KC1分析：刚加入K+时，少量的K+竞争性抑制了 Ca2+的内流，使胞内
8、Ca2+浓度减 小，心肌收缩力下降；经过十几秒后，高浓度的K+扩散到了心肌细胞附近，使心 肌细胞的静息电位迅速升高，前后产生了心肌细胞外轻度高K+和显著高K+的现 象。当到达-55mV时，Na+通道失活，心肌细胞无法引发动作电位而停泊在舒张期。6 加 CaCl2D oDum snt1图7加入CaCl2分析：心肌胞外Ca2+浓度显著增加后，一方面使心肌的自律细胞中的慢反应 细胞自动去极化速度增加，起自律性增强，最终导致心率增加；另一方面，Ca2+ 内流增加，胞浆中的Ca2+浓度增加，肌钙蛋白得到更多的Ca2+，Ca2+兴奋收缩耦联 增加，收缩力明显增强。7 加去甲肾上腺素图8加去甲肾上腺素分析：
9、加入去甲肾上腺素后，与心肌细胞上的B受体结合，增加了肌浆网1对Ca2+的通透性，主要起以下几个方面的作用：使心肌收缩速度增加；（2）使其 自律性增强，心率增加；（3）使肌膜与肌浆网膜对Ca2+的通透性均增加，兴奋收 缩耦联增加，心肌收缩力增加。8 加乙酰胆碱D : Dum anti图9加入乙酰胆碱分析：加入乙酰胆碱后，它与肌膜上的M受体结合，使肌膜对K+的通透性增 加，对Ca2+的通透性降低。这样，一方面导致心率减慢；另一方面使心肌收缩力下降。9 加阿托品图10加入阿托品分析:阿托品能与乙酰胆碱竞争M胆碱受体,从而有阻断乙酰胆碱的作用（阻 断副交感），可以加快心率。10 加1%乳酸图11加入1
10、%乳酸分析:pH值降低干扰肌肉代谢和肌丝滑行的生化过程;肌质网释放Ca2+减少;Ca2+内流减少。11 加 2.5%NaHC03图 12 加入 2.5%NaHCO3分析：HCO-中和了 H+，产生与乳酸相反的过程。3六、注意事项1、蛙心插管时，勿损伤心肌，尤其静脉窦。结扎静脉时，线结应尽量靠下，切 勿伤及静脉窦（起搏点在该处），以免心脏停跳。2、在每项实验观察前，应保持蛙心插管内液面在同一高度。3、药物作用明显时应立即用新鲜任氏液换洗，直至心脏活动曲线恢复正常后再 做下项实验。4、在加化学药物与调换溶液时，须及时做好标记，不要凭记忆而弄错。5、滴管应用药后洗净，避免药物相互混合，影响实验结果。
11、七、实验讨论一）上述理化因素对心脏活动的影响和其作用机理：1、0.65% NaCl:灌流液中缺乏Ca2+，使得心肌内Ca2+浓度大大减小，心肌的兴奋收缩耦联过程减弱。2、Ca2+ :用咼Ca2+浓度灌流蛙心，使细胞内Ca2+浓度不断升咼，Ca2+与肌钙蛋白结合数量增加，肌肉收缩力增强；Ca 2+与肌钙蛋白不易解离，因而舒张不完全。3、K+ : K +与Ca2+有竞争性拮抗作用，高K +浓度抑制Ca2+内流，使进入 细胞的Ca2+减少，心肌兴奋收缩耦联减弱，心肌收缩力减弱，严重时心脏停于 舒张状态。4、去甲肾上腺素：去甲肾上腺素与心肌膜上的B 1受体结合，通过细胞内 第二信使cAMP促使肌质网磷
12、酸化，释放Ca2+速度加快，胞内Ca2+量增加，收缩 力增强；同时Ca 2+泵转运Ca 2+速度加快，舒张速率增加。5、乙酰胆碱：乙酰胆碱与心肌M受体结合，K +通透性增加，K +外流加强， 最大复极电位增加，与阈电位距离变大；同时Ca2+内流减少，产生一系列负 性变作用。6、阿托品：阿托品能与乙酰胆碱竞争M胆碱受体，从而阻断乙酰胆碱的作 用（副交感），可以加快心率。7、心得安：心得安有阻滞肾上腺素的作用（交感），使心率减慢，心脏收缩 力减弱。8、乳酸：pH值降低干扰肌肉代谢和肌丝滑行的生化过程；H +与Ca2+竞争， 与肌钙蛋白结合位点结合，使ATP酶活性降低，对Ca2+的敏感性降低，肌质网 释放Ca 2+减少；H +还能降低Ca 2+通道活性，使Ca 2+内流减少。二）每次换液时，插管内的液面均应保持恒定高度。 以保持灌流液面的恒定即保持液压的恒定，防止液压因素对心脏造成影响。保证 实验的条件一致，是实验可对照的关键。
