《生物信息学论文胡小鹏》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物信息学论文胡小鹏（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、深圳大学考试答题纸(以论文、报告等形式考核专用)二 一 一 二 一 二 学年度第 2 学期课程编号课程名称生物信息学主讲教师苏庆宁李凌云买制刚评分学 号姓名专业年级2012级生物医学工程（医）教师评语：题目：小鼠肿瘤坏死因子启动子荧光素酶表达载体的构建摘要：利用NCBI genebank数据库及genetool软件设计引物，克隆小鼠TNF-启动子序列，将其插入荧光素酶表达载体pGL3-basic中。将经过鉴定的重组载体pGL3-TNF-promoter转染巨噬细胞264.7，应用萤光素酶检测系统检测其活性。1.查找启动子序列：打开NCBI的Map viewer网站，网址，输入要查询的TNF-，
2、得如下结果：再点击右下方quick filter 勾上gene选项，找到TNF-alpha基因所在染色体上的位置：点击17号染色体上的Genes seq（注：下边的几个序列也是一样的，一般选第一个即可）出现如下信息：点击，Download/View Sequence/Evidence，查看基因序列：Sequence Format 选择Genebank 形式，再点击Display,出现：目的基因的相关序列以及信息。可知转录位点从基因1956位开始转录，由于内含子的存在，所以mRNA在DNA上序列上分成了几段。promoter位于转录起始位点上游约2000bp区域，启动子序列为：2. 引物设计用N
3、CBI查出小鼠TNF-的基因的CDS：打开网站：，查询在这段开放阅读框内0 cutter的酶，并结合结合实际情况，使用列表中的Xho 、HindIII作为引物酶。 用genetool软件设计引物：Forward PrimerName: TNF- deg 1-21 Len:21 Score:76*Predicted Melting Temperature: 58 degrees CelsiusGeneTool Score: 76Start: 1 End: 21 Length: 21Bases: 5CCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3Reverse PrimerName
4、: TNF- deg 1934-1956 Len:23 Score:74*Predicted Melting Temperature: 51 degrees CelsiusGeneTool Score: 74Start: 1934 End: 1956 Length: 23Bases: 5CCATAAAGCTTGAGGGAGATGTGGCGCCT 3上游引物P1 5端加入Xho酶切位点（CTCGAG）即5CTCGAGCCCAATTCTCGAGGTTTTCCGAGGGTTGAAT 3下游引物P2 5端加入HindIII酶切位点（AAGCTT）即5AAGCTTCCATAAAGCTTGAGGGAGAT
5、GTGGCGCCT3请外面引物公司合成，扩增基因片段长度为：233bp。3. 基因组DNA提取按组织/细胞基因组DNA快速提取试剂盒说明提取小鼠基因组DNA。-20保存备用。4. 目的片段的扩增以基因组DNA为模板，用上游和下游引物扩增TNF-启动子DNA序列。用genetool软件模拟电泳结果：MWM:DNA marker 1:PCR产物，大小为233bp 图1。TNF-启动子序列PCR产物5.TNF-启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定回收产物的电泳条带，用试剂盒对PCR产物进行纯化。Xho和Hind分别双酶切扩增的TN-F启动子和载体pGL3basic，琼脂糖凝胶分离酶切产物，AXYGEN
6、胶回收试剂盒回收和纯化目的片段。T4 DNA连接酶连接pGL3-basic和TNF-片段过夜，转化感受态细菌JM109，接种含IPTG和X-gal的Amp+LB培养皿培养。取阳性克隆菌酶切、测序。重组体命名为pGL3-TNF-promoter。用genetool软件模拟双酶切电泳结果：MWM:DNA marker 1:重组质粒pGL3-TNF-promoter 图2.限制性内切酶双酶切图6.基因测序结果：7.转染及荧光素酶活性检测实验组将pGL3-TNF-promoter+pRL-SV40（转染效率内参），对照组pGL3-basic+pRL-SV40分别用脂质体Lipofectamine 2
7、000瞬时转染巨噬细胞264.7。实验组、对照组各24孔。转染36 h后，按照双荧光素酶检测试剂盒（Dual Luciferase Assay System）的操作说明处理转染细胞，并通过GloMax 20/20发光检测仪测萤火虫荧光素酶及海肾荧光素酶的荧光值，将两者的比值，作为衡量荧光素酶活性的依据。Reference:1. LIU B.Construction and identification of human puma promoter luciferase report gene vectorJ.Medical Journal of National De-fending Forces in Southwest China,2009,19(1):42-44.2.欧阳华伟，罗成群，曹海梅.小鼠肿瘤坏死因子启动子荧光素酶表达载体的构建及鉴定.中国现代医学杂志.2010 10（20）：1453-1456 / 文档可自由编辑打印
