mTOR抑制剂的筛选方法

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1、mTOR 抑制剂的筛选方法【摘要】雷帕霉素靶蛋白（mTOR）是是丝氨酸/苏氨酸激酶分子靶位。mTOR 是细胞生长增生的中心调控者，直接或间接参与细胞生长增生有关环节的调 控。人体多种肿瘤细胞中可见mTOR通路的失调。近年来，有关mTOR抑制剂的 专利申请不断增加，设计、合成、筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤 药物研发的重大课题。本文就mTOR的结构功能、信号转导通路及mTOR抑制剂 的筛选方法进行简单的介绍。【关键词】雷帕霉素靶蛋白 雷帕霉素靶蛋白抑制剂 药物筛选TOR（target of rapamycin，雷帕霉素靶蛋白）是一类进化上非常保 守的蛋白激酶家族，广泛存在于各种生物细

2、胞中。1994年，Brown等证实并克隆了哺乳动物TOR基因，其产物只有 一种蛋白，即mTOR（mammalian target of rapamycin，哺乳动物雷帕 霉素靶蛋白）。mTOR属P13K蛋白激酶类家族，是P13K / PKB信号通路 下游的一个效应蛋白，其底物主要控制与细胞生长和增殖密切相关 的蛋白质的合成。mTOR控制细胞内mRNA的翻译，参与膜蛋白转 运，蛋白质降解，蛋白激酶C信号转导和核糖体合成等一系列生理病 理过程。1. mTOR的分子结构mTOR分子结构复杂，由2 549个氨基酸残基组成，分子中有数 个各自独立而保守的结构域，类似于酵母中TOR的结构。mToR分子 的

3、氨基端存在20个串联重复序列，每一个重复序列包含2个分别由40 个氨基酸残基组成的a螺旋，每个螺旋都有一个亲水基团和一个疏 水基团。这种重复结构介导蛋白质之间的相互作用，并有利于mTOR 定位于浆膜。mTOR分子羧基端的中部是蛋白激酶域，结构和P13K激酶的催化 域相似。蛋白激酶域的上游是FRB域，为FKBPI2雷帕霉素复合物与 mTOR相互作用的区域，该区发生突变后可以完全阻止雷帕霉素对 mTOR的抑制作用。FRB下游大约500个氨基酸残基处为FAT域，作用 可能是与mTOR分子末端的F ATC域形成一个空间结构，从而暴露 mTOR分子的催化域。FATC域和NRD域位于mTOR分子羧基末端，

4、其 中NRD域在F ATC和激酶催化域之间，是mTOR的负性调节域，而F ATC 域对mTOR的活性有着至关重要的作用，FATC结构中任何一个氨基酸 残基的缺失都能使mTOR丧失催化能力。由于mTOR包含的几个相对独立的结构域都能够和其他蛋白质发 生作用，因而其能结合不同的蛋白质。实际mTOR存在两种复合物形 式，这两种复合物的结构在细胞中都是相对保守的。mTOR形成的两种不同复合物mTORCI和mTORC2。已知的 mTOR对肿瘤细胞生长、分化和代谢的作用均由mTORCI完成， mTORC2对雷帕霉素不敏感。HEAT 二 FAT 二 FR3 二 CD 二 KD 二 FATCSi mTOR骗构

5、就涸FRB区，这个区域为免疫抑制剂FK506结合蛋白与雷帕霉素的结 合位点，是雷帕霉素与mTOR相互作用的区域。所以这个区域突变后 可完全阻止雷帕霉素对mTOR的抑制作用，FRB区之后为激酶区，作 用是使丝氨酸苏氨酸发生磷酸化。最后的FATC为FAT碳末端区。FAT 和F ATC区可调节mTOR激酶的活性。2. mTOR 的信号转导通路mTOR可通过P13K / AKT途径或AMPK途径来发挥作用。目前研究 较多的是P13K / AKT途径。该途径在肿瘤中常被过度激活，使细胞周 期调节失控，引起细胞转化和肿瘤进展。正常情况下，生长因子诱导mTOR的活化是通过激活P13K实现 的。P13K可磷酸

6、化肌糖环3羟基的磷酸肌醇。细胞膜3磷酸磷脂 (P13PS )与Akt的PH区域连接，导致Akt转位至浆膜，从而与磷酸肌醇 依赖性激酶1(PDKl)接触。PDKl负责Akt的磷酸化，从而激活Akt。激活 的Akt可磷酸化结节性硬化复合体2(TSC2併减弱后者对mTOR的抑制 作用。Akt和P13K在功能上属于原癌基因，受到抑癌基因PTEN的负性 调节。PTEN可使肌糖环3羟基的磷酸肌醇磷酸化，在胚胎发育、细 胞迁移、凋亡和有效终止P13K介导的信号转导方面起着关键性的作用。PTEN突变在人类实体肿瘤非常常见。活化的P13K位于细胞膜，可催化磷脂酰肌醇P2转变为磷脂酰肌 醇P3,后者募集并激活AK

7、T。PTEN可以下调PtdlinsP3的浓度。从而抑 制P13K / AKT途径。AKT对mTOR的激活主要通过以下两种方式：一 种是磷酸化mTOR而直接激活它；另一种是磷酸化并抑制TSC1 / TSC2 二聚体。TSCI/TSC2是mTOR最重要的上游信号分子。Rheb是mTOR 激活蛋白，TSCI / TSC2二聚体通过抑制Rheb阻止mTOR的活化。Ccntr&k oftranslation/RegulationX/triaduUtioni M cyda /XapoptDsis/图2 mTOK信号转导通路 figure 2 Signaling uetworlc of mTOK由于P13K

8、 / Akt / mTOR通路分子发生突变或者上游信号通路分 子激活，肿瘤细胞内P13 / Akt / mTOR通路可被激活，从而使细胞增 殖失控、凋亡抗拒以及引起细胞的代谢改变。mTOR经过上述两种途径被活化后可将信号传递给下游通路，通过两种途径调节下游核糖体和mRNA结合，一是使抑制mRNA翻译的 4EBP1磷酸化失活，二是使促进mRNA翻译的S6K1磷酸化而激活， 从而启动核糖体蛋白的翻译。两条途径的最终效应都是促进mRNA翻 译，从而直接或间接调控翻译起始阶段、微丝形成、膜转运、蛋白 降解、蛋白激酶C（PKC）通路、核蛋白体合成、tRNA合成及转录等。激活S6iWJ1F4F!rrTOR

9、 J .3. mTOR抑制剂mTOR抑制剂雷帕霉素及其衍生物能结合FKBP（FKS06结合蛋白）， 抑制mTOR，阻止P70S6K和4EBP磷酸化。同时也间接抑制了其它相关 蛋白转录和翻译，具有抗菌、免疫抑制和抗肿瘤作用。mTOR 抑制剂是具有抗排斥、抗增殖、抗肿瘤及延长哺乳动物寿命等作用的多功能药物。第一个mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin，现称西罗莫司，Sirolimus）及其后来通过化学半合成 获得的西罗莫司衍生物已作为免疫抑制剂用于器官移植的抗排斥反 应、作为雷帕霉素涂层支架治疗冠状动脉支架植入后的再狭窄、作 为治疗肾癌等癌症的 mTOR 靶向抗癌药物。目前又发现雷帕霉素能够治

10、疗老年性痴呆症，也是第一个被报 道能够延长哺乳动物生命的药物。雷帕霉素及其衍生物临床上的新 适应症逐步被开发，它们在治疗罕见病、疑难病症方面可能发挥更 大的作用。近年来，有关mTOR抑制剂的专利申请不断增加，设计、合成、 筛选结构新颖的mTOR抑制剂已经成为抗肿瘤药物研发的重大课题。4. mTOR抑制剂的筛选方法（7）酶联免疫吸附法Elisa）ELISA的原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记 的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定 时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原 或抗体起反应。用洗涤的

11、方法使固相载体上形成的抗原抗体复合 物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通 过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物 质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为 有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据 呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接 地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。抗悴吸附 于載郎表面，洗 涤加特测抗 庾，抗瘵特异性 结合抗体，洗涤13）加酶标记抗 体，结合抗原， 洗涤加底物产生 颜色反应 底物水解重=抗原 存在壘圉3-3测定抗原的双抗擁灭心法原理mTOR的Ser2448磷酸化是上游

12、信号AKT激酶和下游p70S6激酶 反馈作用的结果，通过检测mTOR的Ser2448磷酸化程度可以检测 mTOR的活性。我们找了Abeam公司 的mTOR pSer2448 in vitro ELISA试剂盒，这 个试剂盒是专为在细胞和组织裂解液精确测量mTOR的活性。具体如下：采用mTOR特定的抗体包被微孔板，制成固相载 体，样品吸入孔中，样品中存在的mTOR被固定化的抗体结合到孔 中。洗涤后，在微孔中加入检测抗体。洗去未结合的检测抗体， 将酶标抗体加入孔中。各孔再次洗涤，将TMB底物溶液加入到孔 中，TMB被催化转化成蓝色，蓝色的深浅与磷酸化的Ser2448的数 量呈正相关。加入盐酸停止反

13、应，颜色从蓝色变到黄色，用酶标 仪在450nm波长下测定光密度值（0D值），可计算样品浓度。受检抗原： mTOR phospho Ser2448检测抗体： anti-mTOR phospho Ser2448 detector antibody酶标: HRP-conjugated label specific for the detector antibody底物： TMB检测：最后加入盐酸停止反应，用酶标仪在450nm处测定0D 值。分析：0D值越小，mTOR的Ser2448磷酸化程度越低，抑制剂 作用越强。（2）荧光共振能量转移Fret）荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近（710

14、nm ）时，当供体分子吸收一定频率的光子后被激发到更高的 电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能 量向邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移）。FRET是一种非 辐射能量跃迁，通过分子间的电偶极相互作用，将供体激发态能量 转移到受体激发态的过程，使供体荧光强度降低，而受体可以发射 更强于本身的特征荧光（敏化荧光），也可以不发荧光（荧光猝 灭），同时也伴随着荧光寿命的相应缩短或延长。蛋白质磷酸化是细胞信号转导过程中的重要标志，研究其中的 酶活性是研究信号通路的一个重要方面。利用放射性以及免疫化学 发光等方法检测酶活性，都需要破碎细胞，用细胞提取物测定酶活 性，无法做到活细胞内

15、定时、定量、定位的观测酶活性变化，而利 用FRET方法就可以很好的解决这个问题。利用FRET原理设计了一种新的探针（一种融合蛋白）：新探针 包含一个对已知蛋白激酶特异性的底物结构域，一个与磷酸化底物 结构域相结合的磷酸化识别结构域。这个探针蛋白的两端分别是供 体、受体荧光分子，利用FRET原理工作。当底物结构域被磷酸化 后，分子内部就会发生磷酸化识别结构域与其结合而引起的内部折 叠，两个荧光蛋白相互靠近就会发生能量迁移。实验用到的供体是Thr46 （铽标记的anti-phospho-4EBP1），受 体是绿色荧光标记的4EBP1，是mTOR下游信号通路的蛋白，有活性 的mTOR能磷酸化4EBP

16、1，使之与供体结合。如果mTOR活性受到抑 制，供体受体距离不能达到荧光能量转移的要求，则在515nm处与 485nm处的信号比值增大。抑制剂的活性越大，比值越大。（3）均相时间分辨荧光HTRF）我们找到的是HTRF ADP Transcreener试剂盒。HTRF Transcreener ADP测定是竞争性免疫测定。mTOR是一种 激酶，在反应时会使ATP转化为ADP。ATP转化的ADP与d2标 记ADP竞争性地与铕标记的ADP单克隆抗体结合。当铕标记的ADP单克隆抗体与有标记的ADP相结合后，他们 便能发射荧光；当抗体与没有标记的细胞内ADP结合后，没有荧 光产生。所以，通过检测荧光值的变化，便可量化细胞内的ADP。该测定法包