PCR基因扩增原理

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1、PCR基因扩增实验原理、仪器试剂和操作步骤实验原理：PCR（Polymerase Cha in Reactio n）-聚合酶链式反应，可以选择性扩增一段DNA序歹U。 其基本步骤是，首先将待扩增的模板DNA变性使之成为单链，DNA样品中，特异性的引物能够与 其互补的序列杂交，在dNTPs和Taq酶存在时，就可以合成模板DNA的互补链，反应完成后， 将反应混合物加热使DNA双链变性，温度下降后，过量的引物又可以开始第二轮的合成反应。这 种延伸一变性一退火一延伸的循环可以重复多次，使所需要的DNA片段得到特异性的扩增。1变性：加热使模板DNA在高温下（94C）变性，双链间的氢键断裂而形成两条单链。

2、2退火：使溶液温度降至5060C，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合.3延伸：溶液反应温度升至72C，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下， 利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸（dNTPs），按5-3方向复制出互补DNA上述3 步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一 个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过2530 个循环后DNA可扩增106109倍。典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲 液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。影响PCR的主要因素PCR技

3、术必须有人工合成的合理引物和提取的样品DNA，然后才进行自动热循环，最后进 行产物鉴定与分析。引物设计与合成目前只能在少数技术力量较强的研究院、所进行，临床应用只 需购买PCR检测试剂盒就可开展工作，PCR自动热循环中影响因素很多，对不同的DNA样品， PCR反应中各种成份加入量和温度循环参数均不一致。现将几种主要影响因素介绍如下。温度循环参数在PCR自动热循环中，最关键的因素是变性与退火的温度。如操作范例所示，其变性、退 火、延伸的条件是:94C60s, 37C60S, 72C 120s，共2530个循环，扩增片段500bp。在这里, 每一步的时间应从反应混合液达到所要求的温度后开始计算。在

4、自动热循环仪内由混合液原温度变 至所要求温度的时间需要3060s，这一迟滞时间的长短取决于几个因素，包括反应管类型、壁厚、 反应混合液体积、热源（水浴或加热块）以及两步骤间的温度差，在设置热循环时应充分给以重视 和考虑，对每一仪器均应进行实测。关于热循环时间的另一个重要考虑是两条引物之间的距离；距离越远，合成靶序列全长所需的 时间也越长，前文给出的反应时间是按最适于合成长度500bp的靶序列拟定的。下面就各种温度 的选择作一介绍。1 模板变性温度是决定PCR反应中双链DNA解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链 DNA模板，PCR也就不会启动。变性温度低则变性不完全，DNA双链会很快复性，因

5、而减少产 量。一般取9095C。样品一旦到达此温度宜迅速冷却到退火温度。DNA变性只需要几秒种，时 间过久没有必要；反之，在高温时间应尽量缩短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA 聚合酶后最高变性温度不宜超过95Co2. 引物退火温度退火温度决定PCR特异性与产量；温度高特异性强，但过高则引物不能与 模板牢固结合，DNA扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板错配，非特异性产物增加。一般先由37C反应条件开始，设置一系列对照反应，以确定某一特定反应的最适退火温 度。也可根据引物的(G+C)%含量进行推测，把握试验的起始点，一般试验中退火温度Ta(a nn eali

6、ng temperature)比扩增引物的融解温度TTm(melting temperature)低5C,可按公式进行计算：Ta = Tm - 5C= 4(G+C)+ 2(A+T) -5C其中A，T，G，C分别表示相应碱基的个数。例如，20个碱基的引物，如果(G+C) %含量 为50%时，则Ta的起点可设在55C。在典型的引物浓度时(如0.2pmol/L),退火反应数秒即可 完成，长时间退火没有必要。3. 引物延伸温度温度的选择取决于Taq DNA聚合酶的最适温度。一般取7075C，在72C 时酶催化核苷酸的标准速率可达35100个核苷酸/秒。每分钟可延伸1kb的长度，其速度取决于 缓冲溶液的

7、组成、pH值、盐浓度与DNA模板的性质。扩增片段如短于150bp，则可省略延伸这 一步，而成为双温循环，因Taq DNA聚合酶在退火温度下足以完成短序列的合成。对于100300bp 之间的短序列片段，采用快速、简便的双温循环是行之有效的。此时，引物延伸温度与退火温度相 同。对于1kb以上的DNA片段，可根据片段长度将延伸时间控制在17min，与此同时，在PCR 缓冲液中需加入明胶或BSA试剂，使Taq DNA聚合酶在长时间内保持良好的活性与稳定性； 15%20%的甘油有助于扩增2.5kb左右或较长DNA片段。4. 循环次数常规PCR 一般为2540个周期。一般的错误是循环次数过多，非特异性背景

8、严 重，复杂度增加。当然循环反应的次数太少，则产率偏低。所以，在保证产物得率前提下，应尽量 减少循环次数。扩增结束后，样品冷却并置4C保存。二、引物引物设计要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核苷酸引物，所谓引物，实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离决定扩增片段的长度，两引物的5端决定扩增产物的两 个5末端位置。由此可见，引物是决定PCR扩增片段长度、位置和结果的关键，引物设计也就更 为重要。引物设计的必要条件是与引物互补的靶DNA序列必须是已知的，两引物之间的序列未必清楚， 这两段已知序列一般为1520个碱基，可以用DNA合成仪合成与其对应互补的二条引物，除此

9、之外，引物设计一般遵循的原则包括：1. 引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机 率的为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长 度为2024个核苷酸。这样短的寡核苷酸在聚合反应温度(通过72C)下不会形成稳定的杂合 体。有时可在5端添加不与模板互补的序列，如限制性酶切位点或启动因子等，以完成基因克隆 和其他特殊需要；引物5端生物素标记或荧光标记可用于微生物检测等各种目的。有时引物不起作用，理由不明，可移动位置来解决。2. (G+C)%含量引物的组成应均匀，尽量避免含有相同的碱基多聚体。两个引物中(G+C)% 含量应

10、尽量相似，在已知扩增片段(G+C)%含量时宜接近于待扩增片段，一般以40%60%为 佳。3引物内部应避免内部形成明显的次级结构，尤其是发夹结构(hairpin structures)。4. 引物之间两个引物之间不应发生互补，特别是在引物3端，即使无法避免，其3端互补碱 基也不应大于2个碱基，否则易生成“引物二聚体”或“引物二倍体”(Primer dimer)。所谓引物二 聚体实质上是在DNA聚合酶作用下，一条引物在另一条引物序列上进行延伸所形成的与二条引物 长度相近的双链DNA片段，是PCR常见的副产品，有时甚至成为主要产物。另外，两条引物之间避免有同源序列，尤为连续6个以上相同碱基的寡核苷酸

11、片段，否则两 条引物会相互竞争模板的同一位点；同样，引物与待扩增靶DNA或样品DNA的其它序列也不能 存在6个以上碱基的同源序列。否则，引物就会与其它位点结合，使特异扩增减少，非特异扩增 增加。5. 引物3端配对DNA聚合酶是在引物3端添加单核苷酸，所以，弓I物3端56个碱基与靶 DNA的配对要求必须精确和严格，这样才能保证PCR有效扩增。引物设计是否合理可用PCRDESN软件和美国PRIMER软件进行计算机检索来核定。人工合成的寡核苷酸引于最好经过色谱(层析)纯化或PAGE纯化，以除去未能合成至全长 的短链等杂质。纯化引物在25%乙腈溶液中4C保存可阻止微生物的生长；一般情况下，不用的 引物

12、应保存在-20C冰箱中，在液体中引物能保存6个月，冻干后可保存12年。三、DNA聚合酶早在1956年Kornberg等就从大肠杆菌提取液中发现了 DNA聚合酶，并且得到了 DNA聚合 酶I纯品。DNA聚合酶I是由分子量为109000的一条多肽链构成，此酶可被枯草杆菌蛋白酶分 解为两个片段，一个片段分子量为76000,有聚合酶活性，并有3-5外切酶活力，即Klenow片 段(Kle now fragme nt)。另一个片段分子量为34000，具有5J3外切酶活力。因此，DNA聚合 酶具有几种功能：一是聚合作用，以DNA为模板，将dNTP中的脱氧单核苷酸逐个加到3-OH末 端。二是有3-5外切酶活

13、力，能识别和消除错配的引物末端，与复制过程中校正功能有关。三是 5J3外切酶活力，它能从5端水解核苷酸，还能经过几个核苷酸起作用，切除错配的核苷酸。1985 年Mullis等发明了 PCR方法，以Klenow片段完成0-珠蛋白的PCR后，世界上许多实验室就考 虑用耐热DNA聚合酶代替Klenow片段进行PCR，使耐热多聚酶的研究得以迅速发展。人们从生 活于 60C(B.Stearothermophilus)到 87C(S.Solfatavicus)的许多菌中分离纯化出耐热 DNA 聚合酶，但有些酶不能耐受DNA变性所需温度，所以无法应用于PCR。现就PCR反应中常用的 DNA聚合酶等作一详细介

14、绍。1. Taq DNA聚合酶用Taq DNA聚合酶代替大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段是使PCR普及应用的 关键。Klenow片段不能耐受95C的双链DNA变性温度，所以每次循环都要加入新酶；而Taq DNA聚合酶可以耐受9395C的高温，避免了不断补加多聚酶的繁琐操作，同时使退火和延 伸温度得以提高，减少了非特异性产物和DNA二级结构对PCR的干扰，增进了 PCR特异性、 产量和敏感度，二者相比，其主要区别在于：OKlenow酶的最适温度为37C，扩增的产物并 非全是目的序列，需用探针检测。Taq酶则不仅产率高而特异性也高。它的最适温度为74 75 C。因而使退火温度可以提高，使退

15、火严格性提高，减少错配引物的延伸。循环后期酶 量渐感不足而产生平坡。到达平玻的循环次数，Klenow酶为20个（均用1pg基因组DNA开 始）而Taq酶为30个。延伸片段长度Taq酶为10kb以内，而Klenow酶为400bp以内。Taq酶由水栖高温菌（Thermus aquatics） YT1蓖株中分离而得。此菌于1969年由Brock分 离自美国黄石公园温泉，作为栖热杆菌的标准菌株，其生长温度为7075C。最初从中分离到分 子量6068KDa，比活性为20008000U/mg的DNA聚合酶。后来Cetus公司的Kary Mullis等 又分离到比活为20万U/mg的纯酶，分子量为93910

16、。此种9.4KDa酶的最适温度为7580C， 与单纯核苷酸的结合率（Kcat）可达150核苷酸（nt） /s酶分子。以M13模板，用富含G+C的 30bp 引物延伸，70C 时 Kact60nt/s；55C可达 24nt/s；37C 时为 1.5nt/s,而 22C 时低至 0.25nt/s。 高于90C时DNA合成活性甚差，这种高温条件下，引物与模板已不能牢固结合。在PCR反应混合液中，Taq酶于92.5C,95C及97.5C保持其50%活力的时间分别为130、 40及56min，在50次循环的PCR中当管内最高温度为95C。每循环为20s时尚可保持65% 活力。Taq酶在95C的半寿期为40min，故在PCR循环中选用的变性温度，不宜高于95C。Taq酶现已可用基因重组的方法生产，商品名为Ampli Ta