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1、标题：免疫固定电泳版本号：A文件编号：PLA301-LJK-ZY-MY-24发布日期：2003年3月1日生效日期：2003年3月15日发布部门：临检科质量管理小组编制人：马骏龙、白洁、杨丽审核人：马骏龙批准人(签章)：秦小玲页码：第1页，共6页免疫固定电泳1 检验目的免疫固定电泳是通过分析单克隆Ig的轻链和重链类型，帮助诊断多发性骨髓瘤、重链病、轻链病及半分子免疫球蛋白病的分型诊断，观察疾病的变化及治疗效果具有重要参考价值。2 检测原理免疫固定电泳(immunofixation eletrophoresis，IFE)将血清或其他标本在琼脂(醋酸纤维素)平板上作区带电泳，各种单一蛋白或复合蛋白成
2、分经电泳后按其电荷量、分子大小等所致电迁移率不同而分开。然后在其上加入已知相应单价抗血清(分别含有抗、轻链及各类重链抗血清)，当抗体与其区带中的单克隆Ig结合后，便形成抗原抗体复合物而沉淀(固定)下来。通过漂洗和染色，呈现浓而狭窄的着色区带，即可判断单克隆Ig的轻链和重链类型。3 标本3.1 静脉抽取病人空腹血标本2ml，置于含分离胶或含促凝剂的真空试管内。3.2 采血后应立即送到临床检验科免疫检验室。3.3 样品收到后不能及时测定的血清，应于28冰箱保存。4 设备和试剂4.1 HYDRASYS电泳分析仪(主机号：1423或1876)和HYRYS-PHORESIS光密度扫描系统。4.2 琼脂糖
3、凝胶：法国Sebia公司的琼脂糖凝胶(产品PN4150或4152)为应用型，凝胶内含8g/L琼脂糖和Tris巴比妥缓冲液(pH9.10.1)。4.3 Tris-巴比妥缓冲液：每1份浓缩缓冲液瓶内加1升蒸馏水或去离子水，稀释后Tris-巴比妥溶液为应pH9.10.3。浓缩液可置于室温或冰箱内保存，质量可稳定几年或至少在试剂盒和缓冲液瓶上标签注明的有效日期内。4.4 氨基黑染色液：每1份浓缩染液用蒸馏水或去离子水稀释到300ml，稀释后为工作液(4g/L氨基黑、10%乙酸)。浓缩和稀释液可置于室温或冰箱内保存，浓缩液质量可稳定在试剂盒瓶上标签注明的有效日期内；已稀释的缓冲液盖紧瓶盖在室温内可稳定1
4、年。4.5 结晶紫染色液：1份浓缩结晶紫溶液内加蒸馏水或去离子水至300ml，稀释后为工作染色液(2g/l结晶紫和10乙酸)。将浓缩或稀释之染色液瓶盖拧紧，避免蒸发并置于室温或冰箱内保存。浓缩染液始终保持稳定，至少可稳定在试剂盒瓶上标签注明的有效日期内，已稀释之染液可稳定6个月。4.6 稀释液、固定剂和抗血清：稀释液为应用型(pH为7.50.3的碱性缓冲液、溴酚蓝和防腐剂)；固定液为应用型(内含酸性溶液和防腐剂)，为便于区分，固定液具有特殊的颜色以避免混淆。抗血清均为应用型，所有抗血清内含哺乳动物相应抗人免疫球蛋白抗体，为便于分辨，抗血清的颜色与标签所示颜色一致。在抗血清瓶的标签或试剂盒上注明
5、的有效期内均可使用。4.7 脱色液：浓缩脱色液用蒸馏水或去离子水100倍稀释后为脱色应用液(稀释后脱色液内含柠檬酸5g/L)。脱色液用于凝胶染色后的脱色，以去除剩余的染料。稀释脱色液须拧紧瓶盖，置于室温下可稳定1个月。5 操作步骤5.1 样品准备选择合适的琼脂糖凝胶，每片2IF可检测2个标本，每片4IF可测定4个标本。为了避免由抗原过剩引起的带现象，样本须先如表1稀释后再进行点样。当总免疫球蛋白水平20g/L时，稀释剂量加倍(ELP泳道除外)；当总免疫球蛋白的水平5g/L时，稀释剂量减半(ELP泳道除外)。表1 免疫固定电泳检测血清样品稀释泳道氨基黑染色结晶紫染色血清稀释剂血清稀释剂蛋白电泳图
6、谱(ELP)30 l60 l30 l60 lIgG免疫固定泳道20 l100 l20 l100 l其它免疫固定泳道30 l60 l30 l60 l某些单克隆免疫球蛋白可能因多聚体而导致所有的免疫固定泳道上均出现单克隆片段，在这种情况下，应先将血标本进行处理，用5l-巯基乙醇加于100l未稀释的血清内，混匀并放置12分钟后按规定程序继续进行。5.2 操作方法法国Sebia公司的Hydrasys电泳系统是一种半自动的多元仪器，自动化步骤包括：电泳、用固定剂和抗血清孵育、烘干、染色、脱色和最后烘干。手工步骤包括：加样和处理凝胶、加固定剂和抗血清以及启动仪器。免疫固定是由五种混合多价抗血清进行反应，其
7、步骤为：应用固定剂和抗血清加于凝胶表面的泳道上，并让固定剂和抗血清在凝胶内渗透扩散。使电泳后已分离的蛋白质被固定和产生免疫沉淀。使用吸水纸和清洗液将未沉淀的蛋白质去除，已被沉淀的蛋白质贮留在凝胶内。将凝胶染色，并进行观察比较。5.2.1 电泳1.打开电源。2.将1个(用于2IF)或2个(用于4IF)点样板置于平整表面，孔号位于加样孔上方按序排列。每孔加10l已稀释的样品。每块点样板加样应在2分钟内完成。把点样板放于湿盒内，齿梳向上放置。在最后一个样品加样完毕后让样品于齿梳中扩散5分钟，如果不立即电泳(超过8小时)，则须将整个湿盒置于冰箱内。c.打开电泳舱盖并升起电极和点样支架。注意：在电极及点
8、样支架升起时，不能直接关上电泳舱盖。d.选择“IF”电泳程序(键盘左侧)。e.取出含缓冲液的条带，将条带有塑料末端的那面紧贴电极挂置。f.取出凝胶放于平整界面。用一张薄滤纸轻轻地吸去凝胶表面多余的液体，然后快速移去滤纸。将200l蒸馏水加于电泳框面的下1/3处。弯曲凝胶，将其平铺于电泳框面上，确定凝胶背面的气泡被完全赶走。g.放下二个支架。这时，含缓冲液的条带没有接触凝胶。不要强迫支架完全下降。h.从湿盒中取出点样板。去除齿梳下的保护支架。2IF的点样板置于支架6号位，4IF的2个点样板则分别置于3号和9号。注意：点样板上的数字必须面对操作者。i.关上电泳舱盖。j.马上按键盘左侧(start)
9、键开始。注意：必须确保仪器右侧的空气通道不被堵塞。电泳的具体自动步骤：2个支架下降以便于含缓冲液的条带及点样板与凝胶表面接触。样品点样板支架升起。电泳在20W的恒定功率下进行直到42Vh为止。20恒温由Peltier系统控制。电极支架升起。听到“嘟”声后电泳舱盖解锁。屏幕显示“Reagent application”加试剂。5.2.2 免疫固定1.打开电泳舱盖。2.取出点样板并丢弃。3.移出2个支架，移去缓冲条带并丢弃。4.放置加试剂的模板。5.按表2加抗血清试剂(避免混淆，试剂颜色与瓶上标签及模板上的颜色相对应)。表2 免疫固定电泳抗血清试剂泳道体积(l)试剂颜色ELP40固定液黄色IgG2
10、5抗重链抗血清粉红色IgA25抗重链抗血清深兰色IgM25抗重链抗血清黄绿色Kap25抗轻链抗血清淡绿色Lam25抗轻链抗血清淡兰色6.关上电泳舱盖。7.按左侧键盘的“start”键立即开始，屏幕显示“incubation”孵育。免疫固定的具体步骤：20下孵育5分钟。听到“嘟”声后电泳舱盖解锁。屏幕显示“Elim. Reagent”。5.2.3 去除多余的试剂、清除剩余蛋白质1.打开电泳盖。2.用滤纸吸去多余的试剂。3.按键盘左侧“start”键开始。吸去试剂的具体步骤：试剂于20下在15秒内被吸去。听到“嘟声”，屏幕显示“Paper Blotting”，用滤纸吸。5.2.4 清除剩余蛋白质1
11、.移去滤纸。2.抬起加试剂模板，并将其移开。3.将一张厚滤纸覆于凝胶上，使滤纸边缘对齐一线，覆滤纸于凝胶表面，轻按滤纸表面以确定其完好地贴于凝胶表面。4.关上电泳舱盖，按键盘左侧的“Start”键开始。5.用小刷子清洗模板，不可使用甲醇溶剂清洗。再次使用前确定模板完全干燥。用纸巾擦去孔内的水滴。去除剩余蛋白的具体步骤：温控于40下吸去剩余蛋白质，约3分钟。听到“嘟”声，屏幕显示“Paper+Start”。5.2.6 烘干1.打开电泳舱盖。2.移去滤纸。3.关上盖子。4.按键盘左侧的“Start”键开始。烘干的具体自动步骤：65下烘干6分钟。听到“嘟”声后，电泳舱盖解锁。5.2.6 染色-脱色1
12、.打开电泳舱盖。2.取下烘干的胶片。3.打开凝胶支架，将胶片面向操作者置于支架上，确定胶片被完好地固定于支架上。4.将支架置于染色舱(染色之前作下述检查：洗涤液至少400ml；染色液至少300ml；脱色液至少1L；废液缸空置)。5.选择“IF”染色程序并按右侧键盘“start”键开始。在染色、脱色、和烘干过程中，染色舱始终被锁定。冷却之后听到“嘟”声，染色舱被解锁。电泳舱盖打开后温度下降至20至少需5分钟，将点样支架和电极支架放于原处，取出凝胶支架，此时新一轮电泳即可开始。5.3 结果计算：依次打开电脑主机、扫描仪及打印机。打开扫描仪盖，将凝胶片背面向上，固定于扫描支架上，置于扫描仪中。启动H
13、YRYS-PHORESIS光密度扫描系统相应分析软件，对免疫固定电泳凝胶进行扫描、图像编辑处理，并输出免疫固定电泳结果。6 质量控制每批操作过程中应使用SEBIA公司的质控血清做质量控制。7 干扰因素溶血和不完全凝固标本、严重巨球蛋白血症标本或IM多聚体可干扰试验。8 计算HYRYS-PHORESIS光密度扫描系统会自动地计算出结果。9 实验室解释9.1 多发性骨髓瘤：按M蛋白所属免疫球蛋白类型的不同，多发性骨髓瘤分为若干个亚型：IgG型骨髓瘤：此型最为多见(约为60%以上)；IgA型骨髓瘤：此型次之(约占30%)；IgD型骨髓瘤：较少见(约为1%)；轻链型骨髓瘤：占患者的20%；IgE型骨髓
14、瘤：此型极为罕见；无分泌型骨髓瘤：约1%。9.2 巨球蛋白血症：巨球蛋白血症属于免疫增殖性疾病，以浆细胞样淋巴细胞异常增殖(源自B淋巴细胞)，大量分泌单克隆巨球蛋白，并广泛浸润骨髓和髓外脏器为特征。本病患者血清中大量IgM分子，多以19S(即由五个IgM分子亚单位组成)为主，还有一定数量的7S单位。免疫固定所出现的高聚合成分，陷溶在加样点处的凝胶中，结果在所有的路径上都形成了沉淀。用-巯基乙醇处理，将导致巨球蛋白体积的缩小，这样才能使它的迁移成为可能。血清用还原剂处理后，出现了Kappa-IgM单克隆或Lamda-IgM单克隆区带。9.3 重链病：重链病为浆细胞的恶性增殖性疾患，其特征为所产生
15、的单克隆免疫球蛋白为不完全的重链，而无轻链合成。从道理上讲，人体存在五种免疫球蛋白就有可能产生五种重链病。目前已报告的有4种，即、和，常见为前三种：重链病：血出现链M蛋白，而尿中无轻链蛋白，血清中异常蛋白浓度大于2000mg/dl，沉淀系数为3.54.0S，分子量为4580kD；重链病：血清中出现链M蛋白，而浓缩尿中也可见链M蛋白但无轻链蛋白；重链病：尿中排出大量轻链蛋白，血清中链M蛋白常不明显。9.4 轻链病：轻链病患者常以肾功能损伤而就诊，这是由于轻链病人的M成分是轻链，分子量只有2万多，极易经肾小球滤过而在肾小管沉积，当肾功能尚好时，血中轻链无明显升高。所以，早期血清免疫电泳常不能出现明显的异常。但当肾功能损伤，轻链不能顺利排出时，则血清中轻链升高。该M成分做免疫电泳时即与相应的抗Ig血清反应，也与抗相应的轻链血清发生反应，其沉淀线位置往往前移且与正常Ig的沉淀线相连或相切，出现一条附加的沉淀线。此时如改用抗FC血清，该沉淀线消失。诊断轻链病时必须排除多发性骨髓瘤伴随的轻链血症，如IgD
