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1、RTPCRTPCR - RT-PCR简介 反转录聚合酶链反应reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR是将RNA的反转录reverse transcription 和cDNA的聚合酶链式扩增PCR相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA,再以cDNA为模板,扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。无论使用何种RNA,关键是确保RNA中无RNA酶和基因
2、组 DNA的污染。RTPCR - 原理 只要是利用相关技术提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用OligodT或随机引物利用反转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板经行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RTPCR - 过程 RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中,每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行,然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中,在同时为反转录和PCR优化的条件下,反转录和PCR在一直观众顺次进行。 1、反转录酶的选择两种方法1、Money 鼠白血病病毒反转录酶 有较强的聚合
3、酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。 2、AMV反转录酶 有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适温度为42。 2、合成cDNA引物的选择 用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA,三种都可。 一步法RT-PCR引物的选择： 1. 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。 两步法2. Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。原核生物的RNA、真核生物的 Oligo dT rRN
4、A 和tRNA不具有PolyA尾巴。由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上,所以对RNA样品的质量要求较高,即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。 3. 基因特异性引物 与模板序列互补的引物,适用于目的序列已知的情况。 RTPCR - 影响因素 RT-PCR反应受多个因素影响,如硫酸镁的浓度, 引物退火的温度,扩增的循环数等。 1、建议选择0.5-3.0 mM 的硫酸镁作初步实验。 2、对于具有较高Tm的引物,增加退火和延伸时的温度对反应有利。较高的温度有利于减少非特异的引物结合,因而提高特异产物的得率。 3、大多数目标RNA经40轮PCR反应就能观察到。但如果目标RNA太
5、稀少,或者只有很少的起始材料,有必要增加扩增的次数到45-50次。反向PCR反向PCR反向PCR是一种新型的基因扩增方法,它能扩增一段已知序列旁侧的DNA,也就是说这一反应体系不是在一对引物之间而是在引物外侧合成DNA。反向PCR - 简介 PCR只能扩增两端序列已知的基因片段,反向PCR可扩增中间一段已知序列,而两端序列未知的基因片段不扩增。 反转录PCR反转录PCR又称为逆转录PCR,是指扩增mRNA的一种实验技术。先将mRNA反转录成cDNA,然后再以cDNA为模板,用PCR方法加以扩增。RT-PCR反应原理反转录PCRReverse Transcription-Polymerase C
6、hain Reaction,RT-PCR又称为逆转录PCR。其原理是：提取组织或细胞中的总RNA,以其中的mRNA作为模板,采用Oligo或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增,而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级,使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。 RT- PCRReverse Transcription-Polymerase Chain Reaction即逆转录PCR,是将RNA的逆转录RT和cDNA的聚合酶链式扩增反应
7、PCR相结合的技术。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞/组织中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。 反转录PCR - 一、反转录酶的选择1 Money 鼠白血病病毒MMLV反转录酶：有强的聚合酶活性,RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37。 2 禽成髓细胞瘤病毒AMV反转录酶：有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适作用温度为42。 3Thermus thermophilus、Thermus flavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：在Mn2 存在下,允许高温反转录RNA,以消除RNA模板的二级结构。 4MMLV反转录酶的RNase H-突
8、变体：商品名为SuperScript 和SuperScript。此种酶较其它酶能多将更大部分的RNA转换成cDNA,这一特性允许从含二级结构的、低温反转录很困难的mRNA模板合成较长cDNA。反转录PCR - 二、合成cDNA引物的选择1 随机六聚体引物：当特定mRNA由于含有使反转录酶终止的序列而难于拷贝其全长序列时,可采用随机六聚体引物这一不特异的引物来拷贝全长mRNA。用此种方法时,体系中所有RNA分子全部充当了cDNA第一链模板,PCR引物在扩增过程中赋予所需要的特异性。通常用此引物合成的cDNA中96%来源于rRNA。 2 Oligo：是一种对mRNA特异的方法。因绝大多数真核细胞m
9、RNA具有3端Poly尾,此引物与其配对,仅mRNA可被转录。由于PolyRNA仅占总RNA的1-4%,故此种引物合成的cDNA比随机六聚体作为引物和得到的cDNA在数量和复杂性方面均要小。 3 特异性引物：最特异的引发方法是用含目标RNA的互补序列的寡核苷酸作为引物,若PCR反应用二种特异性引物,第一条链的合成可由与mRNA 3端最靠近的配对引物起始。用此类引物仅产生所需要的cDNA,导致更为特异的PCR扩增。反转录PCR - 三、操作步骤1. 总RNA的提取。 2. cDNA第一链的合成Reverse Transcription：目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售,其原理基本相同,
10、但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。 1在0.5ml微量离心管中,加入总RNA 1-5g,补充适量的DEPC H2O使总体积达11l。在管中加10M OligodT12-18 1l,轻轻混匀、离心。 270加热10min,立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。 然后加入下列试剂的混合物： 10PCR buffer 2l 25mM MgCl2 2l 10mM dNTPmix 1l 0.1M DTT 2l 轻轻混匀,离心。42孵育2-5m
11、in。 3加入Superscript1l ,在42水浴中孵育50min。 4于70加热15min以终止反应。 5将管插入冰中,加入RNase H 1l ,37孵育20min,降解残留的RNA。-20保存备用。 3PCR： 1取0.5ml PCR管,依次加入下列试剂： 第一链cDNA 2l 上游引物10pM 2l 下游引物10pM 2l dNTP 4l 10PCR buffer 5l Taq 酶2u/l 1l 2 加入适量的ddH2O,使总体积达50l。轻轻混匀,离心。 3 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确,可在PCR扩增目的基因时,加入一对参
12、如G3PD的特异性引物,同时扩增参DNA,作为对照。 4 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下观察结果。 5 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统,对电泳条带进行密度扫描。反转录PCR - 四、注意事项1 在实验过程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中,注意避免mRNA的断裂。 2 为了防止非特异性扩增,必须设阴性对照。 3 参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的参有G3PD甘油醛-3-磷酸脱氢酶、-Actin-肌动蛋白等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。 4 PCR不能进入平台期,出
13、现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数,均应通过单独实验来确定。 5 防止DNA的污染： 1 采用DNA酶处理RNA样品。 2 在可能的情况下,将PCR引物置于基因的不同外显子,以消除基因和mRNA的共线性。 巢式PCR巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应,使用两对而非一对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物因为他们在第一次PCR扩增片段的部结合在第一次PCR产物部,使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于,如果第一次扩增产生了错误片断,则第
14、二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,巢式PCR的扩增非常特异。巢式PCR - 定义 巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应,使用两对而非一对PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物因为他们在第一次PCR扩增片段的部结合在第一次PCR产物部,使得第二次PCR扩增片段短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于,如果第一次扩增产生了错误片断,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,巢式PCR的扩增非常特异。巢式PCR - 原理 DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶-Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90以上的高温而不
