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1、专题五 和蛋白质技术课题一的粗提取与鉴定一、提取的溶解性原理包括哪些方面？1在不同浓度溶液中溶解度不同；不溶于酒精。在不同浓度溶液中溶解度有何特点？要使溶解，需要使用什么浓度？要使析出，又需要使用什么浓度？在0.14时溶解度最小；较高浓度可使溶解；0.14可使析出。在溶解细胞中的时，人们通常选用2溶液；将分子析出的方法是向溶有的溶液中缓慢注入蒸馏水，以稀释溶液。酒精是一种常用有机溶剂，但却不能溶于酒精（特别是95冷却酒精），但细胞中蛋白质可溶于酒精。2.从理论上分析，预冷的乙醇溶液具有以下优点。一是抑制核酸水解酶活性，防止降解；二是降低分子运动，易于形成沉淀析出；三是低温有利于增加分子柔韧性，
2、减少断裂。3.采用不溶于酒精的原理，可以达到什么目的？将和蛋白质进一步分离。4.提取还可以利用对酶、高温和洗涤剂的耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对产生影响。温度值为6080，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而不会变性。补充：的变性是指分子在高温下解螺旋，其温度在80以上，如在技术中变性温度在95。5.洗涤剂在提取中有何作用？洗涤剂将细胞膜上的蛋白质，从而瓦解细胞膜。6.当鉴定提取出的物质是否是时，需要使用什么指示剂进行鉴定？在沸水浴条件下，遇二苯胺呈现蓝色。 原理总结：通过利用不同浓度溶液溶解或析出，可以从细胞中提取和提纯
3、；再利用酒精进一步将与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是。二、实验材料的选取不同生物的组织中含量不同。在选取材料时，应本着含量高、材料易得、便于提取的原则。本实验用鸡血细胞做实验材料有两个原因。一是因为鸡血细胞核的含量丰富，材料易得；二是鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长。鸡血细胞破碎以后释放出的，容易被玻璃容器吸附，所以在提取过程中为了减少的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液。三、破碎细胞，获取含的滤液1、若选用鸡血和洋葱作实验材料，则怎样获取含的滤液？在鸡血细胞液中加入一定量蒸
4、馏水并用玻棒搅拌，过滤后收集滤液；切碎洋葱，加入一定量洗涤剂和食盐，搅拌研磨，过滤后收集滤液。2.为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂(细胞膜和核膜的破裂)，从而释放出。3在以上实验中，加入蒸馏水、洗涤剂和食盐的作用分别是什么？过滤时应当选用（滤纸、尼龙布）。血细胞在蒸馏水中大量吸水而张裂；洗涤剂瓦解细胞膜；食盐溶解物质；选用尼龙布进行过滤。4.在处理植物组织时需要进行研磨，其目的是什么？研磨不充分产生什么结果？破碎细胞壁，使核物质容易溶解在溶液中；研磨不充分会使的提取量
5、减少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。具体做法。10鸡血20蒸馏水同方向搅拌3层尼龙布过滤滤液三、去除滤液中的杂质1.为什么反复地溶解与析出，能够去除杂质？用高盐浓度的溶液溶解，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出，就能够除去与溶解度不同的多种杂质。最初获得的滤液含有蛋白质、脂质等杂质，需要进一步提纯。方案一的原理是在不同浓度溶液中溶解度不同；方案二的原理是蛋白酶分解蛋白质，不分解；方案三的原理是蛋白质和的变性温度不同。方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的
6、与蛋白质分开；方案三利用的是和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与分离。四、析出与鉴定1.在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的呈何颜色？滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置23分钟，析出的白色丝状物就是。呈白色。2.怎样鉴定析出的白色丝状物就是呢？具体做法。试管2支，编号甲乙各加等量5溶液甲中放入少量白色丝状物，使之溶解各加4二苯胺，混合均匀沸水浴5观察颜色变化五、实验操作制备鸡血细胞液加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放 加蒸馏水，同一方向快速通方向搅拌过滤，除去细胞壁、细胞膜等。溶解核内 加入至2，同一方向缓慢搅拌析出 加蒸馏水至0.14，过滤，在溶解到2溶液中除
7、去细胞质中的大部分物质。初步纯化 与等体积95冷却酒精混合，析出白色丝状物除去核蛋白、多糖等。鉴定 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色注意事项：在鸡血中加入柠檬酸钠防止凝固；鸡血静置或离心以提高细胞悬液浓度；使用塑料烧杯；使用尼龙布过滤；玻棒沿同一方向搅拌；玻棒搅拌要缓慢（细胞破裂快速搅拌）；玻棒不要碰到烧杯壁；二苯胺试剂要现用现配等。课题二 多聚酶链式反应扩增片段基础知识技术扩增的过程，与细胞内复制过程类似：1细胞内复制条件分析：条件组分作用模板的两条单链提供复制的模板原料四种脱氧核苷酸合成子链的原料酶解旋酶聚合酶打开双螺旋催化合成子链能量为解螺旋和合成子链供能引物为聚合酶提供合成的3端起点2细胞内复
8、制过程的解析：解旋：解旋酶、，两条链打开，形成两条单链。引物结合：在单链3端与反向配对结合。聚合酶结合：聚合酶与模板链结合，标志着单链合成开始。子链合成：聚合酶从引物3端开始，将配对的脱氧核苷酸连接起来。后续加工：聚合酶I将引物切去，并合成空缺处的单链，再由连接酶将不连续的子链连接起来（半不连续合成。先导链，滞后链）3 分子复制的人工控制实验操作步骤 照反应体系配方配制反应液； 将反应体系50L用微量移液器转移到微量离心管（0.5）中；将微量离心管放到仪中；设置仪的工作参数。在仪中大量扩增。4实验注意事项（1）避免外源污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前高压灭菌。（2）缓冲液和酶分装成小份，
9、20低温保存。（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。总结、点评多聚酶链式反应扩增片段原理的复制需要酶、原料、能量、引物的变性和复性受温度影响过程变性复性延伸操作步骤配制反应体系移入离心管放入设置工作参数扩增测定含量稀释调零测定并读数计算课题三 血红蛋白的提取和分离一、实验原理蛋白质的物化理性质：形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万别，由此提取和分离各种蛋白质。1凝胶色谱法（分配色谱法）：（1）原理：分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快；分子量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部，路程长，流动慢。（2）凝胶
10、材料：多孔性，多糖类化合物，如葡聚糖、琼脂糖。（3）分离过程： 混合物上柱洗脱大分子流动快、小分子流动慢收集大分子收集小分子洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。（4）作用： 分离蛋白质，测定生物大分子分子量，蛋白质的脱盐等。2缓冲溶液（1）原理：由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成（如H233， 2424等），调节酸和盐的用量，可配制不同的缓冲液。（2）缓冲液作用：抵制外界酸、碱对溶液的干扰而保持稳定。3凝胶电泳法：（1）原理：不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。（2）分离方法：琼
11、脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳等。（3）分离过程：在一定下，使蛋白质基团带上正电或负电；加入带负电荷多的，形成“蛋白质复合物”，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。二、实验步骤1样品处理红细胞的洗涤洗涤红细胞的目的是去除杂蛋白，采集的血样要及时采用低速短时间离心分离红细胞，然后用胶头吸管吸出上层透明的黄色血浆，将下层暗红色的红细胞液体倒入烧杯，再加入五倍体积的生理盐水，缓慢搅拌10，低速短时间离心，如此重复洗涤三次，直至上清液中没有黄色，表明红细胞已洗涤干净。血红蛋白的释放 在蒸馏水和甲苯作用下，红细胞破裂释放出血红蛋白。注：加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞
12、膜，有利于血红蛋白的释放和分离。2粗分离分离血红蛋白溶液 将搅拌好的混合溶液离心后，试管中的溶液分为4层。第一层为无色透明的甲苯层，第2层为白色薄层固体，是脂溶性物质的沉淀层，第3层是红色透明液体，这是血红蛋白的水溶液，第4层是其他杂质的暗红色沉淀物。将试管中的液体用滤纸过滤，除去之溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。透析 取1的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300的物质的量的浓度为20的磷酸缓冲液中，透析12h。透析可以去除样品中分子量较小的杂质，或用于更换样品的缓冲液。3纯化调节缓冲液面：打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到与凝 胶面
13、平齐，关闭出口。加入蛋白质样品：用吸管将透析后的样品沿管壁环绕移动加到色谱柱的顶端。加样后， 打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全渗入凝胶层后， 关闭出口。调节缓冲液面：加入20的磷酸缓冲液到适当高度洗脱：连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口，进行洗脱。收集分装蛋白质：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集。4.纯度鉴定聚丙烯酰胺凝胶电泳（选做）三、注意事项电泳技术电泳技术就是在电场的作用下，利用待分离样品中各种分子带电性质以及分子本身大小、形状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而达到对样品进行分离、鉴定或提纯的目的。2. 红细胞的洗涤如果分层不明显，可能是洗涤次数少、未能除
14、去血浆蛋白的原因。此外，离心速度过高和时间过长，会使白细胞和淋巴细胞一同沉淀，也得不到纯净的红细胞，影响后续血红蛋白的提取纯度。3如何检测凝胶色谱柱的装填是否成功由于凝胶是一种半透明的介质，因此可以在凝胶柱旁放一支与凝胶柱垂直的日光灯，检查凝胶是否装填得均匀。此外，还可以加入大分子的有色物质，观察色带移动的情况。如果色带均匀、狭窄、平整，说明凝胶色谱柱的性能良好。如果色谱柱出现纹路或是气泡，轻轻敲打柱体以消除气泡，消除不了时要重新装柱。4为什么凝胶的装填要紧密、均匀？如果凝胶装填得不够紧密、均匀，就会在色谱柱内形成无效的空隙，使本该进入凝胶内部的样品分子从这些空隙中通过，搅乱洗脱液的流动次序，影响分离的效果。5沸水浴处理加入洗脱液的湿凝胶的目的不但节约时间，还能除去凝胶中可能带有的微生物和排除凝胶内的空气。675“G”代表凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围，75表示凝胶得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5g。7装填完后，立即用洗脱液洗脱的目的：使凝胶装填紧密8加入柠檬酸钠有何目的？为什么要低速、短时离心？为什么要缓慢搅拌？防止血液凝固；防止白细胞沉淀；防止红细胞破裂释放出血红蛋白。9与其他真核细胞相比，红细胞的特点及这一特点对进行蛋白质的分离
