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1、.聚合酶链式反应（PCR ）原理DNA 的半保留复制时，双链DNA 在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验条件下，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA 的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、 dNTP 就可以完成特定基因的体外复制。PCR 类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性- 退火 (复性） - 延伸三个基本反应步骤构成：模板 DNA 的变性：模板DNA 经加热至 94 左右一定时间后
2、，使模板DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板 DNA 与引物的退火 (复性 )：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 4060 左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA 模板- 引物结合物在DNA 聚合酶的作用下，于72 左右，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2 4 分钟， 2 3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍
3、。PCR 技术分类 （常用）（ 1 ）反向 PCR 技术 (InversePCR, IPCR) ： 反向 PCR 是克隆已知序列旁侧序列的一种方法主要原理是用一种在已知序列中无切点的限制性内切酶消化基因组DNA 后酶切片段自身环化以环化的DNA作为模板，用一对与已知序列两端特异性结合的引物，扩增夹在中间的未知序列。该扩增产物是线性的DNA 片段，大小取决于上述限制性内切酶在已知基闲侧翼DNA 序列内部的酶切位点分布情况。用不同的限制性内切酶消化，可以得到大小不同的模板DNA ，再通过反向 PCR 获得未知片段。（ 2 ）锚定 PCR 技术 (Anchored PCR, APCR)：用酶法在一通
4、用引物反转录cDNA3 - 末端加上一段已知序列 , 然后以此序列为引物结合位点对该 cDNA 进行扩增 , 称为 APCR 。（ 3 ）不对称 PCR 技术 (asymmetricPCR) ：两种引物浓度比例相差较大的PCR 技术称不对称 PCR。在扩增循环中引入不同的引物浓度 , 常用 50 100 1 比例。在最初的 10 15个循环中主要产物还是双链DNA, 但当低浓度引物被消耗尽后, 高浓度引物介导的PCR 反应就会产生大量单链 DNA 。（ 4 ）反转录 PCR 技术 (reverse transcription PCR, RT-PCR)：当扩增模板为 RNA 时, 需先通过反转录
5、酶将其反转录为cDNA才能进行扩增。应用非常广泛, 无论是分子生物学还是临床检验等都经常采用。（ 5 ）巢式 PCR 技术 (NEST-PCR)：先用一对靶序列的外引物扩增以提高模板量, 然后再用一对内引物扩增以得到特异的PCR带 , 此为巢式 PCR。若用一条外引物作内引物则称之为半巢式PCR。为减少巢式 PCR 的操作步骤可将外引物设计得比内引物长些, 且用量较少 , 同时在第一次 PCR 时采用较高的退火温度而第二次采用较低的退火温度, 这样在第一次 PCR 时 , 由于较高退火温度下内引物不能与模板结合 , 故只有外引物扩增产物 , 经过若干次循环 , 待外引物基本消耗尽, 无需取出第
6、一次 PCR 产物 , 只需降低退火即可直接进行 PCR 扩增。这不仅减少操作步骤, 同时也降低了交叉污染的机会。这种PCR 称中途进退式PCR，主要用于极少量 DNA 模板的扩增。（ 6 ）多重 PCR 技术 (multiplexPCR) ： 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段,如果基因的某一区段有缺失,则相应的电泳谱上这一区带就会消失。主要用于同一病原体的分型及同时检测多种病原体、多个点突变的分子病的诊断。（ 7 ）重组 PCR 技术： 重组 PCR 技术是在两个PCR 扩增体系中 , 两对引物分别由其中之一在其5 -端和 3- 端引物上带上一段互补的序列 ,混合两种PCR 扩增产
7、物 ,经变性和复性 ,两组 PCR 产物互补序列发生粘连,其中一条重组杂合链能在PCR 条件下发生聚合延伸反应 ,产生一个包含两个不同基因的杂合基因。.（ 8 ）原位 PCR 技术： 利用完整的细胞作为一个微小的反应体系来扩增细胞内的目的片段,在不破坏细胞的前提下, 利用一些特定的检测手段来检测细胞内的扩增产物。直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行扩增，可进行细胞内定位，适用于检测病理切片中含量较少的靶序列。（ 9 ）荧光定量实时PCR 技术反应动力学PCR 的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升，最终DNA 扩增量可用Y=(1+X) n 计算， Y 代表 DNA 片段扩
8、增后的拷贝数， X 表示平均每次的扩增效率，n 表示循环次数。平均扩增效率理论值为100% ，但实际情况达不到，反应初期靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR 产物的逐渐积累，被扩增的DNA 片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，此效应称平台期，与DNA 聚合酶数量和活性、PCR 扩增效率、非特异性产物的竞争等因素有关。PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分，短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5 端之间，是需要扩增的特定片段。短、长产物片段是由于引物所结合的模板不同而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA 为模板，引
9、物是从 3端开始延伸，其5 端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是长产物片段。进入第二个反应周期后，引物除与原始模板结合外，还要同新合成的链（长产物片段）结合引物在与新链结合时，由于新链模板的5 端序列是固定的，故这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点、止点都限定于引物扩增的序列以内，形成长短一致的短产物片段。由于短产物片段是按指数倍数增加，而长产物片段则以算术倍数增加，故可忽略不计，使得PCR 的反应产物不需再纯化既可以保证足够纯的DNA片段供分析、监测。反应五要素-引物、模板、 DNA 聚合酶、四种dNTP 、 Mg 2+（ 1 ）引物设计？引物长度： 15-30b
10、p，常用为 20bp左右。引物扩增跨度：以200-500bp为宜，特定条件下可扩增长至10kb 的片段。引物碱基： G+C 含量以 40-60% 为宜， G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 最好随机分布，引物自身连续互补碱基不能超过3 个，一对引物间也不易多于四个连续碱基的互补性。【引物的 GC 含量和 Tm 值应该协调： Tm=4 （ G+C ）+2 （ A+T ）】避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是3 端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。引物 3端 为关键碱基，是PCR 延伸的起始端，不能进行任何修饰，也不能形成二级结构的可
11、能，一般3端也不能发生错配，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致PCR 失败。5端 无严格限制，只起限定PCR 产物长度的作用，对扩增特异性影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量： 每条引物的浓度 0.1 1umol 或 10 100pmol ，以最低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（ 2 ）DNA 聚合酶： 目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应，一
12、种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR 反应约需酶量0.5-2.5 U/50 ml，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。.（ 3 ）dNTP 的质量与浓度： dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH 或 1M Tris-HCL 的缓冲液将其PH 调节到 7.0 7.5 ，小量分装， -20 冰冻保存。多次冻融会使dNTP 降解。在 PCR 反应中， dNTP 应为 50 200umol/L ，尤其是注意 4种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制 )，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低 )，就会引
13、起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。（ 4 ）模板 (靶基因 )核酸： 模板核酸的量与纯化程度，是PCR 成败与否的关键环节之一，传统的DNA 纯化方法通常采用SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。 SDS 的主要功能是： 溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白， SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于PCR 反应。（ 5 ）Mg 2+ 浓度： Mg 2+ 对 PCR 扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR 反应中，各种 dNTP浓度为 200umol/L时，Mg 2+ 浓度为 1.5 2.0mmol/L为宜。 Mg 2+ 浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。RT-PCR - 是将 RNA 的反转录（ RT）和 cDNA的聚合酶链式扩增（ PCR）相结合的技术。总 RNA 提取 （ -70 保存）Trizol 法：1、取组织 100 于玻璃匀浆器中，加入 1ml Trizol冰上抽打匀浆
