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1、中山大学硕士学位论文netrin-1及其受体DCC/UNC5H2参与高血压大鼠局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑继发性细胞凋亡专 业 名 称：神经病学学 位 申 请 人：龚琼导师姓名及职称：余剑副教授答辩委员会主席：答辩委员会委员：2011年5月原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名： 日期： 年 月 日学位论文使用授权声明本人完全了解中山
2、大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版和纸质版，有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进入学校图书馆、院系资料室被查阅，有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检索，可以采用复印、缩印或其他方法保存学位论文。学位论文作者签名： 导师签名：日期： 年 月 日 日期： 年 月 日中山大学硕士学位论文 netrin-1及其受体DCC/UNC5H2参与大脑皮层梗死后丘脑继发性细胞凋亡netrin-1及其受体DCC/UNC5H2参与高血压大鼠局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑继发性细胞凋亡专 业 名 称：神经病学学 位 申 请 人：龚琼导
3、师姓名及职称：余剑副教授中文摘要目的：检测大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)后netrin-1及其受体DCC(Deleted in colorectal cancer)/UNC5H2（uncoodinated-5 homolog B）在梗死灶同侧丘脑的表达情况；用netrin-1进行干预后，观察比较netrin-1组与溶剂对照组之间丘脑继发性细胞凋亡以及神经功能的差异，探讨细胞凋亡是否参与脑梗死后远隔丘脑继发性损害，侧脑室注射netrin-1能否减轻脑梗死后远隔丘脑继发性损害，改善神经功能。背景：脑卒中是危害人类健康和生命的主要疾病，
4、随着人口老龄化,目前已成为全球仅次于缺血性心脏病的第二大死亡原因。近年来随着神经影像技术的飞速发展，脑梗死临床诊断水平有了飞速发展，但由于对脑缺血后神经功能损伤的机制缺乏深入了解,脑梗死的治疗却不容乐观。以往对缺血性卒中的研究多关注梗死病灶局部。近年来的研究表明，大脑中动脉闭塞(MCAO)不仅可以导致局部梗死灶的神经细胞死亡，而且非缺血区的远隔部位（例如：丘脑、黑质、脑干及脊髓等）也可以引起继发性损害，这种损害称为远隔损害。脑梗死后远隔部位的继发性损害可能是卒中康复效果不理想、致残率高的重要原因之一。目前,通过研究脑梗死后远隔损害的发病机制,寻找新的临床治疗靶点已成为脑梗死研究领域的热点问题。
5、方法：选取体重7090g雄性大鼠140只按双肾双夹法复制易卒中型肾血管性高血压大鼠（Stroke-prone renovascular hypertensive rats，RHRSP）模型并监测血压。RHRSP术后12周，选取血压稳定高于180mmHg，且无明显脑卒中症状的高血压大鼠112只，按电凝法成功复制右侧MCAO模型72只，另随机选取24只作为假手术组，MCAO模型鼠随机分为MCAO组、溶剂对照组和netrin-1组。MCAO术后24小时，netrin-1组大鼠经侧脑室注入浓度为50g/ml的外源性netrin-1蛋白，注入剂量为12l/天，连续7天，溶剂对照组大鼠注入不含netrin
6、-1的等量0.01M磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer saline，PBS，PH=7.4)。MCAO术后第8天和第14天，采用提高后躯体摆动实验（elevated body swing tes t, EBST）对运动功能进行评价，神经功能评价结束后分别从每组随机选取6各组大鼠灌注取脑，行冰冻切片，然后选取切片进行尼氏染色评估梗死体积和丘脑神经元数量变化，原位末端转移酶标记（terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay, TUNEL）法检测大鼠梗死侧丘脑凋亡细胞数
7、，用免疫荧光检测各组大鼠不同时间点梗死侧丘脑NeuN/netrin-1及其受体（DCC/UNC5H2）的表达，荧光双标法评估NeuN/netrin-1、NeuN/DCC、NeuN/UNC5H2、GFAP/netrin-1、GFAP/DCC、GFAP/UNC5H2的共定位关系。此外，MCAO术后8天和14天，每组大鼠分别选取6只进行处死取脑，提取丘脑蛋白，Western blotting检测caspase-3活性蛋白的表达。结果：RHRSP术后12周大鼠血压明显高于RHRSP术前1周的基础血压。MCAO术后第8天,MCAO组、溶剂对照组、netrin-1组脑梗死体积占对侧半球的相对百分比分别为1
8、4.341.73，14.421.37和11.071.24；MCAO术后第14天，MCAO组、溶剂对照组、netrin-1组脑梗死体积分别为11.151.29、11.871.24、8.131.05，netrin-1组大鼠脑梗死灶体积各时间点均较同期溶剂对照组缩小。MCAO术后第8天、14天，MCAO组、溶剂对照组、netrin-1组同侧丘脑腹后外侧核(ventroposterior nucleus of the thalamus, VPN)完好神经元数量较假手术组明显减少，但netrin-1组较溶剂对照组完好神经元数量明显增多。MCAO术后第8天、14天，MCAO组、溶剂对照组、netrin-1
9、组同侧丘脑TUNEL阳性细胞数较假手术组明显增多，但netrin-1组较溶剂对照组TUNEL阳性细胞数减少。MCAO术后8天MCAO组、溶剂对照组和netrin-1组同侧丘脑NeuN免疫阳性细胞数较假手术组明显减少，但netrin-1组较溶剂对照组NeuN免疫阳性细胞数明显增多。MCAO术后第8天, MCAO组较假手术组大鼠梗死侧丘脑UNC5H2表达上调，术后第14天UNC5H2表达进一步增加，MCAO术后netrin-1及DCC在梗死侧丘脑的表达也略有增加，但与假手术组比较差异无统计学意义。MCAO术后第8天、第14天，MCAO组较假手术组右侧丘脑caspase-3活性蛋白的表达水平明显升高
10、，给予netrin-1干预后，右侧丘脑caspase-3活性蛋白的表达水平较溶剂对照组明显减少。结论：大脑中动脉区域局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN出现继发性细胞凋亡，UNC5H2表达上调。大脑中动脉区域局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑VPN的UNC5H2主要表达在神经元上，少量表达在星型胶质细胞上。侧脑室注入netrin-1抑制UNC5H2诱导的细胞凋亡途径，能减少局灶性大脑皮层梗死后同侧丘脑的继发性细胞凋亡。关键词：脑梗死；丘脑；凋亡；netrin-1；DCC；UNC5H2Netrin-1 and its receptor DCC/UNC5H2 are Involved in the Apo
11、ptosis and Secondary Damage in the Ipsilateral Thalamus after Focal Cerebral Cortical Infarction in Hypertensive RatsMajor: NeurologyName: Gong QiongSupervisor: Professor Yu Jian AbstractObjective Detect the expression of netrin-1 and its receptors in ipsilateral thalamus after cerebral infarction.
12、To intervene by netrin-1 then to examine the differences of the numbers of apoptotic cells and neurological functions between vehicle group and netrin-1 group in order to investigate whether netrin-1 and its receptors take part in the apoptosis and secondary damage in thalamus and affect neurologic
13、functions after MCAO.Background Cerebral infarction is seriously harmful to human health and lives, and has become the second largest cause of death in the world after carcinogenic stroke. With the rapid development of the neuroimaging technique, the level of clinical diagnosis of cerebral infarctio
14、n has been made a substantial progress. But the treatment remains a difficult problem owe to the lack of understanding of the pathogenesis after cerebral infarction. Previous researches are focus on the injury of peri-infarct area after cerebral infarction, In recent years, researches demonstrated t
15、he neural functional disturbance following cerebral infarction not only correlates with the injury in focal areas but also the secondary damage remote from infarction. Probably this is one of the most important reasons of bad rehabilitation efficacy and high mutilation rate after stroke. The mechanism of the secondary damage remote from infarction is still unclear. Nowadays, it becomes a hot topic to investigate the underlying mechanisms of secondary damage and explore new effective strategies to treat cerebral infarction.
