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2、(9S匸。SMEOelpoes) 矚只M骰隠骰蝴爪0辿OOT-A卿忙亚迟抵丽驱坦a喺川HBF匱ssrn州只只摄 81gsffig廿世祖奠01S凶女邂E三皿味* BS】咪二、鳖畫判醫WB小曲酒是中国白酒的主要酒种之一，传统小曲酒是以小曲作为糖化剂和发酵剂，以 高粱、大米、玉米、小麦等为原料酿造而成，具有一种清雅的香气和醇甜的口感。 小曲白酒的生产，由于具有设备简单，投资少、点多面广、操作简便、发酵期短、 出酒率高、用曲量少、原料广泛、适于地产地销等特点而深受酿酒厂家和广大消费 者喜爱1-2。川法小曲酒的研究主要集中在提高其产酒率和风味上，因此优良菌种的筛选及应用 至关重要。李锐利3从收集到的小曲
3、酒酒曲中分离筛选出一株产乙酸乙酯性能 较高的酵母菌株BY2，在优化产酯条件下BY2的产酯量为4.812 g/L，较优化之 前的方案产酯量提高了37.5%；邓开野等4从甜酒曲中经分离、诱变、筛选后 得到1株高糖化力的根霉菌株，在最优培养条件下，糖化力达到1 317 mg/(hg),具有一定应用价值；张翠英等5 通过添加低产高级醇菌株进行小曲酒半固态发酵，小曲酒酒精度、残糖、总酸和总酯基本无影响，但却使高级醇含量大幅度下降，与纯小曲发酵相比降低了37.2%。从发酵基质和自然界中直接筛选 培育耐高浓度酒精的酵母菌，是目前获取高产酒精酵母的一种既经济又实用的方法6，这些酵母菌在人工生产中经过不断驯化，
4、在高产、耐高浓度酒精及遗传性 能方面比较稳定。本研究从曲样中筛选适应力较强、发酵力强、产酒性能良好的酵 母，为后续应用于小曲白酒生产的研究奠定基础，对提高原料的出酒率和成品酒的 质量稳定性也有一定的积极作用。1.1 材料与试剂1.1.1 菌种及主要试剂成都、泸州等地的10种不同曲样中分离出的18株酵母，编号Y-1 Y-18。试饭 对比小曲为市售酒曲。3 , 5-二硝基水杨酸(3 , 5-dinitrosalicylic acid , DNS )、 氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride , TTC)(均为分析纯)：成 都市科龙化工试剂厂。1.1.2培养基T
5、TC上层培养基7,TTC下层培养基7;酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose medium，YEPD )培养基8;马铃薯葡萄糖琼脂 (potato dextrose agar, PDA )固体培养基；葡萄糖发酵培养基；20Bx大米 粉发酵培养基9;20Bx高粱发酵培养9。1.2 仪器与设备MYT型糖度仪：上海沪粤明科技仪器有限公司；Super Alcomat型酒精度测定仪: 北京桑翌实验仪器研究所；UV-200型紫外可见分光光度计：上海尤尼柯有限公司； LHR型智能生化培养箱：上海齐欣科学仪器有限公司；BS-2F型数控恒温摇床培 养箱：常州精成国华仪器
6、有限公司；MLS-3020型全自动高压灭菌锅：日本三洋 公司。1.3 试验方法1.3.1 产酒酵母的初筛将从6种曲样中分离纯化的酵母菌株接种至TTC下层培养基上，30工条件下倒置 培养48 h后倒入TTC上层培养基，保温2 h观察菌落颜色深浅。1.3.2 产酒酵母的复筛将经TTC初筛获得的酵母菌接种到YEPD培养基中30工、110 r/min培养24 h。 取活化菌液计数调整菌悬液中酵母细胞数为108CFU/mL，按10%的接种量分别 接种于高粱发酵培养基、葡萄糖发酵培养基、大米粉发酵培养基中，于30工静置 发酵。每隔12 h振荡称质量并记录CO2失重，直到12 h的CO2失重v 0.2 g时
7、 停止发酵，每株菌设计3个平行对照组，筛选出最适发酵培养基和CO2失重较好 的产酒酵母进行三级筛选。1.3.3 产酒酵母的三级筛选将复筛获得的产酒酵母接种到YEPD培养基中110 r/min、300C培养24 h，取活 化菌液计调整菌悬液中酵母细胞数为108CFU/mL , 10%的接种量接种至1.3.2中 筛选出的最适发酵培养基中，30工条件下静置发酵84 h，发酵结束后采用DNS 法测定样液中的残糖10-11,比重法测定100 mL蒸馏样液中的酒精度，每株 菌设计3个平行对照组。1.3.4 产酒酵母的鉴定 将筛得的酵母送往上海杰李生物技术有限公司进行鉴定。1.3.5 酵母曲与根霉曲的复配试
8、饭 将筛选出的优良产酒酵母制作成纯种酵母曲12，并和根霉曲进行复配，复配 方案如表1所示。将复配好的曲接入60 g蒸熟的大米中，于30工条件下培养箱 中培养48 h后取出，用DNS法测定其试饭糖分，滴定法测定酸度13,比重 法测定蒸馏液的酒精度，每组做3个平行，并与市售小曲进行对比。2.1 产酒酵母的初筛TTC可与酵母的代谢产物产生显色反应，酵母的产酒精能力越强则与TTC反应后 菌落的呈色越深,利用 TTC 培养基对 18 株酵母进行初筛,显色结果如图 1 所示。 由图 1 可知,颜色较深（较红）的 7 株酵母菌株编号分别为 Y-10、Y-12、Y-13、 Y-14、Y-16、Y-17、Y-1
9、8,将经过TTC平板筛选得到的酵母做进一步复筛。2.2 产酒酵母的复筛 发酵周期和发酵速度是考察酿酒酵母发酵性能的重要指标,酵母菌利用可发酵性糖, 生成乙醇和二氧化碳,因此可利用发酵过程中发酵液减少的二氧化碳量来衡量酵母 的发酵性能14。将 7 株菌 Y-10、Y-12、Y-13、Y-14、Y-16、Y-17、Y-18 制成菌悬液，稀释至细胞数为108CFU/mL，按10%的量接种于装有100 mL发 酵培养基的三角瓶中，每株菌设计3个平行对照组，每12 h观察产气情况及质量 变化情况,结果见图2。由图2可知，筛选菌种在相同条件下经84 h发酵后，大米粉发酵培养基的CO2失重整体高于葡萄糖发酵
10、培养基和高粱发酵培养基；在3种发酵培养基中，7株酵 母起酵速度都比较快，其中 Y-16、Y-17 和 Y-18 的累积 CO2 失重都在较高水平， 最高在9.95 10.77 g，发酵速度上也优于其他菌，各项指标都较为稳定，随培养 基的变化波动较小。综合以上分析，丫-16、Y-17和Y-18的发酵性能较好且相对 稳定，故选用菌株Y-16、Y-17和Y-18进行三级筛选。2.3 产酒酵母的三级筛选将Y-16、Y-17、Y-18三株菌接种于大米粉发酵培养基中，30工静置发酵84 h检 测其酒精度与残糖指标，结果如图3所示。酵母发酵消耗糖生成酒精，残糖量越低则酒精度越高。由图3可知， 3株菌的发酵
11、性能良好，经过84 h发酵后酒精度均8.8%vol，残糖量均在v 1.8 g/100 mL ;菌株 Y-18在糖度为20Bx的发酵液中有较好的发酵特性，残糖量较菌株Y-16和 菌株Y-17低，还原糖利用率高，发酵比较彻底，产酒精能力也相对于其他两株菌 较强，其残糖量和酒精度分别为0.69 g/100 mL和10.3%vol。2.4 产酒酵母的鉴定15利用ITS1和ITS4 对引物对菌株Y-18的rDNA-ITS序列进行PCR扩增，并对 扩增序列测序，用BLAST将测序结果与GenBank数据库中的序列进行比较并构 建系统发育树，结果见图4。由图4可知,Y-18与Saccharomyces ce
12、revisiae SCPW 17聚在簇的相似度为100%，表明其很可能属于酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae )中的一个种。2.5 纯种酵母与根霉的复配曲试饭试验试饭试验是检验小曲质量的有效方法，通过分析试饭后蒸馏液的酸度、酒精度及残 糖可以在一定程度上反应出小曲在实际生产中的情况。本试验利用菌株Y-18的纯 种曲与实验室筛选的株优良根霉制作的根霉曲进行复配，并与市售小曲进行试饭 试验对比，其结果如图5所示。由图5可知，酵母菌和根霉在生长上存在一定的相互影响；根霉曲的量多有利于 前期的糖化过程，使得曲的糖化力增强，可为酵母发酵产酒提供更多的糖，酵母曲 有利于后期的产酒
13、，随着酵母曲量的增加试饭的酒精度也随之升高，酸度也有一定 增加；在所考察的复配方案中，A10的试饭糖分最低、酸度适中、酒精度最高， 其酒精度为7.24%vol。而对比市售小曲酒精度为2.34%vol，还原糖的含量比较 高，说明对比小曲的发酵速度明显慢于实验组。因此就48 h内复配曲试饭的整体 效果来看，试验组要好于对比市售小曲，该试验组菌种配比可作为小曲制作的参考 配比。经TTC显色试验、产气实验、和发酵实验，从18株酵母中筛选出一株优良的产酒 酵母Y-18，其菌落与TTC显色后呈深红，在大米粉发酵培养基中静置发酵84 h 后的CO2失重为10.77 g、酒精度为10.3%vol、残糖为0.6
14、9 g/100 mL，经分 子鉴定确定其为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ），将该菌株制作成纯种 的酵母曲并和根霉曲进行复配研究，试饭结果表明，复配方案A10的试饭效果最 佳，其糖度为4.63%、酸度为9.5 g/100 mL、酒精度为7.24%vol，可作为利用 该菌株生产小曲的参考依据，因此，酵母菌Y-18作为生产小曲的菌种具有较好的 应用价值。【相关文献】1沈怡方白酒生产技术全书M .北京：中国轻工业出版社，1998.2 李一川高质量小曲白酒的研究D 武汉：湖北大学硕士论文，2014.3 李锐利高产乙酸乙酯酵母的选育及在清香型小曲酒中的应用研究D 武汉：湖北工
15、业大学 硕士论文，2011. 4 邓开野，林佩芳，黎尔纳.甜酒曲中产糖化酶根霉菌株紫外诱变选育 J .食品科学，2012， 33（7）：204-208. 5 张翠英，张艳英，齐亚楠，等.低产高级醇酿酒酵母工程菌株在小曲酒酿造中的应用 J .酿 酒科技，2013（7）：62-64.6王 鹏提高小曲微生物发酵性能的研究D.南昌：江西农业大学硕士论文，2014.7 郜希璐白酒窖泥中酵母菌的分离鉴定及发酵特性研究D.天津：天津大学硕士论文，2009.8KREGER V R N J W.The yeasts ： a taxonomic study M .Netherlands ： Elsevier Science Publishers B.V.，1984.9贺小贤，常海山，丁 勇，等.陕西稠酒小曲中高产酒精酵母的筛选和鉴定 J .食品科技， 2011，36（3）：10-13.10 王春晓，江 璐，刘延琳.DNS法监控葡萄酒发酵进程的应用研究J.中国酿造，2012 , 31（9）：24-27.11许 鹏，贾士儒，谭之磊，
