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1、CRISPRCas9基因编辑操作步骤及详细说明实验材料与方法一、细胞培养人宫颈癌细胞HeLa，常规培养使用含10% FBS的DMEM培 养基(含 1.5 mg/L-Glutamine,100 U/mL Penicillin,100 pg/mL Streptomycin)中，37C 5% CO?饱和湿度培养箱中培养。二、基因信息及双 gRNA 设计基因信息及分析1. hsa-mir-152 基因信息:pubmed2. hsa-mir-152基因位于蛋白编码基因COPZ2内含子内，敲除 hsa-mir-152 基因不会影响该蛋白编码3. hsa-mir-152 precursor 序 列 (87
2、bp): TGTCCCCCCCGGCCCAGGTTCTGTGATACACTCCGACTCGGGC TCTGGAGCAGTCAGTGCATGACAGAACTTGGGCCCGGAAGG ACC双gRNA设计使用在线 gRNA 设计软件在 hsa-mir-152 precursor 基因组序列两侧设计双 gRNA编号序列靶点方向理论缺失dgRNAlAGCGCAGGTCCAGCCCGGCC AGG上游+132 bpGAAGGACCTTCTGCACCCAA CGG下游+dgRNA2TCAGCTGGAAGAAGGAGGCT CGG上游+102 bpCTGTGCCCGTTGGGTGCAGA AGG下游-dg
3、RNA3GTGTATCACAGAACCTGGGC CGG上游-54 bpAGTCAGTGCATGACAGAACT TGG下游+注：dgRNA即为双gRNA.三、慢病毒侵染实验材料及试剂DMEM 培养基 + 10% FBSD-Hanks SolutionTrypsin-EDTA Solution96孔板24孔板Lentivirus-病毒液（GenePharma ）步骤靶细胞侵染实验1. 靶细胞铺板：24-well，加入2.5x105cells/well （根据细胞种类 调整），0.5 mL完全培养基，37C, 5% CO过夜；2. 稀释病毒：稀释液（靶细胞维持液培养基l00pL +终浓度5pg/
4、mL Polybrene，将慢病毒原液按1:9加入到稀释液中；3. 移去Stepl中细胞培养液，加入Step2稀释后的病毒液，同时建 立对照（blank、negative ）,37C, 5% CO?过夜；4. 1224小时移去细胞侵染后的病毒液，加入.5 mL完全培养基， 37C, 5% CO 过夜；5. 根据细胞状2态和类型， 如果必要分出 1/31/5， 加入0.5 mL完全培养基，纟继续培养2448小时，荧光倒置显微镜 下观察结果。四、鉴定引物及突变检测鉴定引物PCR引物序列WTMThMIR152-dg-FAGTTCTGGGTCCGTTTGGAGTGG461 bp461bp-理论缺失hM
5、IR152-dg-RGGCCCTAGGATACATCCTCAGGC试剂和仪器Genomic DNA Extraction kitPCR 基因扩增仪电泳仪基因组DNA的提取1. 将收到的细胞6000 rpm，离心2分钟，去上清；2. 加入10 pL的ddHf,重悬细胞，加入9 pL的GB buffer、1 pL 的Pro K、0.5 pL的RNase A,充分混匀后，将EP管安插在泡沫 板上，放至56C水浴锅里温浴10分钟；3. 将裂解液转移至新的0.5 mL的EP管中，放至PCR仪上，95C 处理10分钟，以失活其中的蛋白酶（Pro K）;4. 得到细胞的基因组用于PCR检测。PCR 检测1.
6、 PCR 反应体系组分终浓度用量2xMax buffer1x25 pLdNTP Mix(10 mM)0.2 mM1 pLhMIR152-dg- F (10 pM)0.4 pM2 pLhMIR152-dg- R (10 pM)0.4 pM2 pL基因组DNA模板2 pLMax DNA 聚合酶(2.5 U/pL)1 U/pL1 pLdd HQ17 pL2. PCR 反应程序循环步骤温度时间循环数预变性95 C3分钟1变性95 C15秒退火60C15秒42延伸72C25秒终延伸72C5分钟1保存16C1分钟13. PCR产物的测序鉴定使用hMIR152-dg-F和hMIR152-dg-R引物进行PC
7、R及测序。hsa-mir-152敲除PCR检测结果B dgl dg2U 翳DMA marker；对照细咆卩CR检测蜡果：亦I：甬慢病毒及hsa-nir-152 dsRNM病秦共佞染树勰 MR捡测结果； 屯2： Cas9ftS4.hsa-mi152 dHNA2病毒共僵染仙胞 TO?检测结呆； ds3r Cas9ft#hsa-mir- 152-daRNAS病巻共侵染细Jfc PCRfe测詰果；五、最小致死浓度摸索及稳筛株筛选实验材料及试剂DMEM 培养基 + 10% FBSD-Hanks SolutionTrypsin-EDTA SolutionPuromycin24孔板步骤1. 细胞在6 cm
8、dish中培养至8090%融合时，弃去培养液，用J mL D-Hanks solution洗涤细胞两次；2. 加1 mL Trypsin-EDTA Soluti,o混匀后，小心吸去胰酶溶液，37C 放置13分钟；3. 在加入2 mL完全培养基，吹打使细胞形成单细胞悬液；4. 血球计数板计数，将细胞稀释至3x105 cells/mL ;5. 按1.5x105细胞/孔的浓度接种24孔板，混匀后于37C，5%CO 培养 24小时；26. 完全培养基稀释Puromycin至4pg/mL，两倍倍比稀释，最小 浓度为0.25 pg/mL，换入24孑b板中，同时设置Blank孔，一周 后观察结果。7. 用观
9、察到的细胞全部死亡孔中的最小浓度作为稳筛株的筛选浓度六、细胞有限稀释和单克隆筛选鉴定实验材料及试剂DMEM 培养基 + 10% FBSD-Hanks SolutionTrypsin-EDTA Solution96孔板24孔板步骤1.在96孔细胞培养板中分别加入）OpL的完全培养基；2将待稀释细胞消化成细胞悬液，计数，用完全培养基稀释至mL;3. 取10 pL细胞悬液到96孔板的第一排孔，混匀后，从中取10pL 稀释的细胞悬液至第二排孔，此排孔内细胞浓度为 101/100 pL ;4. 重复上述步骤，第三排孔内细胞数为1/孔，置37C, 5% CO培2养箱，4天后取出观察，并在板盖上打上标记;5
10、. 继续培养时，在第 45天更换 1/2培养基，选择单克隆生长孔，生长良好，转移到 24孔板再扩大培养。6. 单克隆筛选PCR检测结果hsa-mi r-152融除宙克逢睛隆Pf R检测结果细胞基因组使用hMIFU52-Hg-F和hMIR1524g-R引物进行PCR段测序注：WT-Wild Tpye； MT-Mutation Type7. 单克隆测序结果hsa-mir-152基因敲除3号单克隆细胞株测序序列与野生型序列 比对结果门 I111丹IIWIEIE：I戶1旳 IFII据 I粋 Iui 1BS-XO-1 GiSlMOCHiClMWDZI閔加如GWii做irlES-n =阙讹OMMCrMfi
11、KCT如立。苗俩旳宜加口?曲02肢0心沁血皿沁应曲尬比0工沁IQHCCCmmibKIirKTCbT.C-annivt町対Ij5l:hil却1却1却1却1llPl主：1却I毎1BiaElG2-tO-l hcumnch:bwaTTJcrc-Jsxrrr-xbsr/titct-ktthk阳:触mvwi6瞬网:晰如电删tevwxt却叶匚nrrm:审田KE)aEj底mp底用:附広I僚m皤due巨LEGBKKK*K |B!tKiUt：jCrEpBBJ(5S31gRMA 5iGrhld aNLSORFNLSgRhi4 5caffald 1CMV pnxrnfcr 皿户CW pfTxnoterHW-1J_LRHIV-1 jppwkWPRECMV prarclcrHW-1JLLTRU3PPTIukPEFla promoterGft59XXFUkCMV promoter rf
