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1、总则1.范围 本规范规定了化妆品微生物检验的基本要求。 本规范适用于化妆品样品的采集、保存及供检样品制备。2. 仪器和设备2.1 天平。2.2 高压灭菌器。2.3 振荡器。2.4 三角瓶， 250mL 。2.5 玻璃珠。2.6 琉璃棒。2.7 刻度吸管， 1mL、10mL 。2.8 研钵或均质器。2.9 恒温水浴箱。3. 培养基和试剂3.1 生理盐水成分：氯化钠蒸馏水加至溶解后，分装到加玻璃珠的三角瓶内，3.2 SCDLP 液体培养基成分：8.5g1000mL每瓶90 mL , 103.43kPa (121 C 15 lb)20min 高压灭菌。酪蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钾 葡萄糖
2、 吐温 80 蒸馏水17g3g5g2.5g1g7g 1000mL制法：先将卵磷脂在少量蒸馏水中加温溶解后，再与其它成分混合， 加热溶解，调pH为7.27.3分装，103.43 kPa(121 C 15 lb)20min高压灭菌。注意振荡，使沉淀于底层的吐温80充分混合，冷却至 25C左右使用。注：如无酪蛋白胨和大豆蛋白胨，也可用多胨代替。3.3 灭菌液体石蜡。3.4 灭菌吐温 80。4. 样品的采集及注意事项4.1 所采集的样品，应具有代表性，一般视每批化妆品数量大小，随机抽取相应数量的包装单位。检验时，应分别从两个包装单位以上的样品中共取10g或10mL。包装量小于20g的样品，采样量可适当
3、增加样品包装数量。4.2 供检验样品，应严格保持原有的包装状态。容器不应有破裂，在检验前不得打开，防止样品被污染。4.3 接到样品后，应立即登记，编写检验序号，并按检验要求尽快检验。如不能及时检验，样品应放在室温阴 凉干燥处，不要冷藏或冷冻。4.4 若只有一个样品而同时需做多种分析，如细菌、毒理、化学等，则宜先取出部分样品做细菌检验，再将剩 余样品做其它分析。4.5 在检验过程中，从打开包装到全部检验操作结束，均须防止微生物的再污染和扩散，所用器皿及材料均应 事先灭菌，全部操作应在无菌室内进行，或在相应条件下，按无菌操作规定进行。4.6 如检出粪大肠菌群或其它致病菌，自报告发出之日起该菌种及被
4、检样品应保存一个月。5. 供检样品的制备5.1 液体样品5.1.1 水溶性的液体样品，可量取10mL加到90mL灭菌生理盐水中，如样品少于10mL,仍按10倍稀释法进行。如为5mL则加到45mL灭菌生理盐水中，混匀后制成1： 10检液。5.1.2 油性液体样品，取样品 10mL,先加5mL灭菌液体石蜡混匀，再加 10mL灭菌的吐温80,在40 C44C水浴 中充分混合，制成 1： 10检液。5.3 固体样品称取10g，加到90mL灭菌生理盐水中，充分振荡混匀，使其分散混悬，静置后，取上清液作为1: 10的检液。如有均质器，上述水溶性膏、霜、粉剂等，可称10g样品加入90mL灭菌生理盐水，均质
5、1min2min ;疏水性膏、霜及眉笔、口红等，称 10g样品，加入10mL灭菌液体石蜡，10mL吐温80,70mL灭菌生理盐水，均质 3min5min。、菌落总数1. 范围 本规范规定了化妆品中菌落总数的检验方法。本规范适用于化妆品菌落总数的测定。2. 定义本规范采用下列定义菌落总数( Aerobic bacterial count )是指化妆品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、培养温 度、培养时间、pH值、需氧性质等)，1g(1mL)检样中所含菌落的总数。所得结果只包括一群本方法规定的条件下生长 的嗜中温的需氧性菌落总数。测定菌落总数便于判明样品被细菌污染的程度，是对样品进行
6、卫生总评价的综合依据。3. 仪器和设备3.1 三角瓶， 250mL。3.2 量筒， 200mL。3.3 pH 计或精密pH试纸。3.4 高压灭菌器。3.5 试管：15X 150mm3.6 灭菌平皿：直径 9cm。3.7 灭菌刻度吸管， 10mL、 1mL。3.8 酒精灯。3.9 恒温培养箱：36 C 1C。3.10 放大镜。4. 培养基和试剂4.1 生理盐水：见总则中 3.1 。4.2 卵磷脂、吐温 80- 营养琼脂培养基成分：蛋白胨 20g牛肉膏3g氯化钠5g琼脂15g卵磷脂1g吐温 807g蒸馏水1000mL4.2.1 制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温 80, 将其他成
7、分（除琼脂外）加到其余的蒸馏 水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80,混匀，调pH值为7.17.4,加入琼脂，103.43kPa （121 C 15 lb）20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。4.3 0 . 5%氯化三苯四氮唑（ 2,3,5-triphenyl terazolium chloride,TTC ）成分：TTC0.5g蒸馏水1000mL溶解后过滤，103.43kPa （121 C 15 lb）20min高压灭菌，装于棕色试剂瓶，置4C冰箱备用。5. 操作步骤5.1 用灭菌吸管吸取 1: 10稀释的检液2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1mL。另取1mL注入到9mL灭菌生理盐
8、水试管中（注意勿使吸管接触液面），更换一支吸管，并充分混匀，制成1: 100检液。吸取2mL,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿 1mL。如样品含菌量高，还可再稀释成1 : 1000,1 : 10000,等，每种稀释度应更换1支吸管。5.2 将融化并冷至 45C50C的卵磷脂吐温 80营养琼脂培养基倾注到平皿内，每皿约 15 mL,随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36C 1C培养箱内培养48h 2h。另取一个不加样品的灭菌空平皿，加入约 15mL卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，待琼脂凝固后，翻转平皿，置36C 1C培养箱内培养 48h 2h,为空白对照。5.3 为
9、便于区别化妆品中的颗粒与菌落，可在每100mL卵磷脂吐温80营养琼脂中加入1mL0.5%的TTC溶液，如有细菌存在，培养后菌落呈红色，而化妆品的颗粒颜色无变化。6菌落计数方法先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大 5倍10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后，求出 同一个稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若 片状菌落不到平皿中的一半，而其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘以2, 以代表全皿菌落数。7. 菌落计数及报告方法7.1 首先选取平均菌落数在 30 个 300 个之间的平皿，作为菌落总数测定的范围
10、。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表1 中例 1）。7.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在 30 个 300 个之间，则应求出两菌落总数之比值来决定，若其比值小 于或等于 2,应报告其平均数，若大于 2则报告其中稀释度较低的平皿的菌落数（见表 1中例 2及例 3）。7.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300 个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例 4）。7.4 若所有稀释度的平均菌落数均小于30个，刚应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表1中例 5）。7.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30个300个之间，其中
11、一个稀释度大于 300个，而相邻的另一稀释度小于 30 个时，则以 30 或 300 的平均菌落数乘以稀释倍数报告之（见表 1 中例 6）。7.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每g或每mL小于10 CFU。7.7 菌落计数的报告，菌落数在 10以内时，按实有数值报告之，大于 100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见表 1报告方式栏)在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。表1细菌计数结果及报告方式例次不同稀释度平均菌落数两稀释度 菌数之比菌落总数(CFU/mL或 CFU/g)扌艮告方式(CFU/m
12、L 或 CFU/g)10-110-210-311365164201640016000 或 1.6 X 10422760295461.63800038000 或 3.8 X 10432890271602.22710027000 或 2.7 X 1044不可计4650513513000510000 或 5.1 X 105527115270270 或 2.7 X 10范围本规范规定了化妆品中粪大肠菌群的检验方法。本规范适用于化妆品中粪大肠菌群的检验。 定义本规范采用下列定义粪大肠菌群(Fecal coliforms )系一群需氧及兼性厌氧革兰氏阴性无芽孢杆菌，在44C 0.5 C培养24h48h能发
13、酵乳糖产酸并产气。该菌直接来自粪便，是重要的卫生指标菌。 仪器3.1 恒温水浴箱或隔水式恒温箱：44 C 0.5 Co3.2 温度计。3.3 显微镜。3.4 载玻片。3.5 接种环。3.6 电磁炉。3.7 三角瓶，250mLo3.8 试管：15X 150mm3.9 小倒管。3.10 pH计或pH试纸。3.11 高压灭菌器。6不可计305123050031000 或 3.1 X 1047000V 1X 10V 1 X 10*CFU:菌落形成单位。三、粪大肠菌群3.12 灭菌吸管， 10mL、 1mL。3.13 灭菌平皿：直径 90mm。4. 培养基和试剂4.1 双倍乳糖胆盐（含中和剂）培养基 成
14、分： 蛋白胨 猪胆盐 乳糖0.4%溴甲酚紫水溶液 卵磷脂 吐温 80 蒸馏水40g10g 10g 5mL2g 14g 1000mL吐温 80 溶解到少量蒸馏水中。 将蛋白胨、 猪胆盐及乳糖溶解到其余的蒸馏水中，加到一起混匀，68.95 kPa (115C 10 lb)20min4. 2 伊红美蓝（ EMB ）琼脂成分：蛋白胨10g乳糖10g磷酸氢二钾2g琼脂20g2%伊红水溶液20mL0.5%美蓝水溶液13mL蒸馏水1000mL制法：先将琼脂加到900mL蒸馏水中，加热溶解，然后加入磷酸氢二钾、蛋白胨，混匀， 补足至1000mL。校正pH值为7.27.4,分装于三角瓶内，103.43 kPa （121 C 15 lb）15min 糖并加热融化琼脂。冷至60 C左右无菌操作加入灭菌的伊红美蓝溶液，摇匀。倾注平皿备用。4.3 蛋白胨水（做靛基质试验用） 成分： 蛋白胨（或胰蛋白胨） 氯化钠5g蒸馏水1000mL制法：将上述成分加热融化，调pH值为7.07.2.分装小试管，103.43 kPa （121 C使之溶解。再以蒸馏水高压灭菌备用。 临用时加入乳20g15 lb）15min 高压灭菌。制法： 将卵磷脂、 调pH到7.4,加入0.4%溴甲酚紫水溶液，混匀，分装试管（每支试管中加一个小倒管）
