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1、Transwell实验原理与操作步骤Trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思,well有小室的意思，可以从字面上理解， 这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Transwell说明书中的介绍，可以认 为这是一种膜滤器(Membrane filters)，也可认为是一种有通透性的支架(permeable supports)。更准确地说,Transwell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Transwell 小室( Transwe l l chamber，Transwe l l insert ) ，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子， 不同厂家对Transwell会有不同
2、的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实验 需要，可有不同选择。但无论是何种外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张 有通透性的膜，而杯子其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有 0.1 12.0如，根据不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜(polycarbonate membrane)。将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培 养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内， 由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下 层培养液中
3、的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、 细胞侵袭等多种方面的研究。当然不同细胞其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这 里主要谈几种大家常用的实验：( 1 )共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不 需要细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0pm以下孔径。常用0.4、3.0pm。我们实验室用的 是0.4pm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质 对细胞A的影响。( 2)趋化性实验：可用 5.0、 8.0、 12.0pm 膜，上室细胞可穿过聚碳酸
4、酯膜进入下室，计数进入下室的细 胞量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞 B分泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋 化因子对细胞的趋化作用。( 3)肿瘤细胞迁移实验：常用8.0、12.0pm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤 细胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。(4)肿瘤细胞侵袭实验常用8.0、12.0pm膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。transwell侵袭实验，其实原理简单地说
5、就是用一层膜将高营养的培养液和低营养的培 养液隔开，细胞放在低营养的培养液里，为了找吃的，细胞会往高营养的培养液里面跑，但 是有膜挡着，所以要穿过膜才行。我们在膜上涂上一层基质胶，模仿细胞外基质，于是细胞 要把基质消化了才可以从低营养的培养液跑到高营养的培养液里面，最后我们检测高营养的 培养液里细胞量就可以知道细胞的侵袭能力了，大概原理就是这样的。第一节概念这里想明确两个概念，一个是Transwell,另一个是肿瘤细胞侵袭模型。I.Transwell关于Tran swell这个词该如何解释，查了很多资料也未见准确的注解，我觉得可以这么理 解吧，trans-这个词根有转移、转运、穿过等意思，we
6、ll有小室的意思，可以从字面上理 解，这是一类有通透性的杯状的装置，根据Corning公司的Tran swell说明书中的介绍， 可以认为这是一种膜滤器(Membrane filters)，也可认为是一种有通透性的支架(pe rmeable supp or ts)。更准确地说，Tran swell应该是一种实验技术，这项技术的主要材料是Tran swell小室 (Transwell chamber, Transwell insert)，其外形为一个可放置在孔板里的小杯子， 不同厂家对Transwell会有不同的命名，而不同型号也可有不同形状，不同大小，根据实 验需要，可有不同选择。但无论是何种
7、外形，其关键部分都是一致的，那就是杯子底层的一张有通透性的膜，而杯子 其余部分的材料与普通的孔板是一样。这层膜带有微孔，孔径大小有0.1 12.0pm，根据 不同需要可用不同材料，一般常用的是聚碳酸酯膜(polyca rbon ate memb rane)。下图是一个Tran swell装置的纵切面将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上室内盛装上层培养液，下室内盛装下层培养液，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔。我们将细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞，从而可以研究下层培养液中的成分对细胞生长、运动等的影响。应用不同孔
8、径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、 细胞侵袭等多种方面的研究。下面参考 guxuefeng 战友和 cosmosci 战友的帖子具体来谈谈孔径的选择，当然不同细胞 其体积不同，具体选择时要考虑到细胞大小。这里主要谈几种大家常用的实验：（1）共培养体系：小于3.0um孔径条件下，细胞不会迁徙通过，因此，若研究不涉及细胞运动能力，不需要 细胞穿过聚碳酸酯膜，则应选择3.0pm以下孔径。常用0.4、3.0pm。我们实验室用的是 0.4|jm。将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分泌或代谢产生的物质对细胞A的 影响。（2）趋化性实验可用5.0、8.0、12
9、.0pm膜，上室细胞可穿过聚碳酸酯膜进入下室，计数进入下室的细胞 量可反映下室成分对上室细胞的趋化能力。 细胞B对细胞A的趋化作用：将细胞A种于上室，细胞B种于下室，可以研究细胞B分 泌或代谢产生的物质对细胞A的趋化作用。 趋化因子对细胞的趋化作用：将细胞种于上室，下室加入某种趋化因子，可研究该趋化因 子对细胞的趋化作用。（3）肿瘤细胞迁移实验常用8.0、12.0pm膜，上室种肿瘤细胞，下室加入FBS或某些特定的趋化因子，肿瘤细 胞会向营养成分高的下室跑，计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的迁移能力。（4）肿瘤细胞侵袭实验常用 8.0、 12.0pm 膜，原理与肿瘤细胞迁移实验类似。下室跑，但
10、与肿瘤细胞迁移实验不同的是，聚碳酸酯膜上室侧铺上一层基质胶，用以模仿体 内细胞外基质，细胞欲进入下室，先要分泌基质金属蛋白酶MMPs）将基质胶降解，方可 通过聚碳酸酯膜。计数进入下室的细胞量可反映肿瘤细胞的侵袭能力。2.肿瘤细胞侵袭模型用于研究肿瘤细胞侵袭能力的肿瘤细胞侵袭模型有如下几种（引自司徒镇强细胞培养）2.1 体内癌细胞侵袭模型2.1.1 皮下移植侵袭模型2.1.2 肌肉内移植侵袭模型2.1.3 腹腔内移植侵袭模型2.1.4 小鼠肾包膜下移植侵袭模型2.1.5 鼠睾丸包膜下移植侵袭模型2.1.6 小鼠耳廓皮下移植侵袭模型2.1.7 鼠爪垫皮下移植侵袭模型2.1.8 视网内界膜侵袭模型2
11、.2 体外癌细胞侵袭模型2.2.1 体外静止器官培养法2.2.1.1 半固体培养基单细胞器官培养法2.2.1.2 液体培养基单细胞器官培养法2.2.2 半体外半体内器官培养法2.2.3 单层细胞器官培养法2.2.4 瘤细胞球体器官培养法2.2.4.1 静止球体器官培养法2.2.4.2 旋转摇动球体器官培养法2.2.5 单层细胞侵袭实验模型2.2.6 Transwell 侵袭小室测定法可见，Tran swell与侵袭实验之间并不能划等号，Tran swell有多种应用，侵袭实验也有多 种方法。所谓 Transwell 侵袭实验，其实是指将 Transwell 这一技术应用于肿瘤细胞侵袭 研究的一
12、种实验。由于其简单易行、重复性好，因而得到了越来越广泛的应用，但不能认为 研究肿瘤侵袭只有 Transwell 一种方法。第二节 Transwell 侵袭实验我的课题涉及Tra nswel I侵袭实验和Tra nswell迁移实验，其他方面的Tran swell应用我 不太清楚，因此这里主要谈谈 Transwell 侵袭实验。1.实验用品： Transwell 小室：多种厂家可提供，论坛里常用的是Costar、Corning、BD生产的小室，我们实验室用的 是 Chemicon 公司的 ECM550 系列，另有 Boyden chamber、Millip ore 公司的 millicell 和
13、雕弓满月射天狼战友介绍的 Thincert。这些厂家提供的小室，有的已铺好基质胶，买来就可以用，很方便，但也比较贵，我们实验 室用的Chemicon公司的ECM550系列是已经铺好胶的，质量很好，但是非常贵，24孔 板配套的小室，每个价格约130元，不推荐给大家。BD也有已包被好的，价格不清楚。 Coster 和 Corning 公司生产的小室，是论坛里比较常用的，好像是要自己铺胶，但据说每 个小室成本只有40左右，应该比较适合中国国情。下面是一些战友提供的价格，具体建议大家联系代理商咨询。linanping1979战友提供的 价格：coster的24孔板的transwell的价格是456元R
14、MB,8pm,用于肿瘤的侵袭实验。 iceyxy 战友提供的价格：Millip ore 的 8pm 的 50 个 1760RMB,0.4|jm 的 2000 多，是一 次性的。梅林战友提供的BD价格：240RMB 一块(6.5um,24孔,12instert)，好像是 没胶的diguofan说国产的boyden30块一个。jjyy提供的价格是:corning cat No.3422.6.5mm transwell with 8.0um prore polycarbonate membrane insert, Qty 48,950 人民币不到。平均每个 20 元不到。Transwell 小室按照
15、公司的要求，都是一次性使用的。不过其实洗洗泡泡还是可以重复用的。我用的Chemicon公司的ECM554,用完后擦去基质胶，再用胰酶和75%酒精泡，可以 把膜洗得很干净，用前用紫外里外都照30min。swordO1战友提供的处理方法：用棉签轻 轻擦去胶和反面细胞，清水冲洗，超声清洗，低挡，30min,清水3x5min,蒸馏水3x5min, 室温凉干，用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波，低火10minx2。因为我买的是铺好胶的，所以没买Matrigel,二次利用的小室只用来做不需要铺胶的迁移 实验。以前的Chemic on ECM550系列，膜很结实，擦不坏，可以反复用很多次，但现在 的膜已
16、经改用一种很薄很脆的材料，一般只能重复用一次，真黑啊！很多战友说Costa r和 Corning 也是可以重复用的，大家可以试试。本人没见过，有兴趣的可以自己研究一下。另外，根据论坛战友提供的信息,osmo nic公司有专用的膜出售，鼎国生物代理。Tran swell 小室用过后，可把原来的膜切下，贴上osmo nic公司的膜，这样又可以用了，不过我没用 过，有兴趣的可以试试。 maojianwen 战友的使用方法： trasnwell 小室做一次后，将原 来的膜去掉，重新泡酸，泡酒精，使用前照紫外，然后用女士用指甲油（注意用无色较稀的） 将osmonic公司的膜贴上，剪掉多余的边缘。再照紫外。 上层培养液： 上层培养液采用无
