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1、PerkinElmer4For tin BetterPerkinElmer公司液相色谱现场培训教材i 页PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材Flexar LC-Chromera美国珀金埃尔默仪器（上海）有限公司PerkinElmer4FortAiBEttETPerkinElmer公司液相色谱现场培训教材第一部分：液相色谱基本工作原理及基本知识第二部分：液相色谱仪标准化操作流程SOP第三部分：液相色谱软件(Chromera)操作第四部分：液相常见问题第一部分：液相色谱基本工作原理及基本知识液相色谱工作原理：是利用混合物中各组份在不同的两相中溶解，分配，吸附等作用性能的差异，当两相作相对
2、运动时，使各组分在两相中反复多次受到上述各作 用力而达到相互分离，从而按一定次序由固定相中先后流出。与适当的柱后检测方 法结合，实现混合物中各组分的分离与检测。两相中有一相是固定的，叫作固定相(Stationary Phase),即色谱柱；有一相是流动的，称为流动相(Mobile Phase),流动相 又叫洗脱剂或溶剂。液相色谱仪实际照片如下:图1-1常见配置Flexar LC高效液相色谱仪外观# |页Perkin Elmer4PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材_/Aaj# |页废液图1-2高效液相色谱仪系统示意图样品组分分离示意图RE6POZ6EIsolventTIME图1-3样
3、品组分分离示意图Perkin Elmer4PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材图1-4 Flexar LC色谱泵结构示意图1 .液相色谱在各个行业的应用在医药行业：药物中有效成分的含量、相关物质分析、药代分析、药物中间体的分析等;在环境保护工作中：可用来监测土壤，大气和水的质量；在食品工业中：可用于各种营养成分、非法添加剂、兽药、农药等的监控分析；在农业上可用来监测农作物中残留的农药；在石化上可用于各种添加剂、高聚物分子量等测定；生命科学上用于氨基酸、多肽、蛋白质及核酸等的分析；在公安用于鉴别药物中毒或毒品类型.2 .液相色谱的各个组成部分 由以下五大系统组成：高压色谱泵、进样器、色
4、谱柱、柱温箱、检测记录系统。组分能否分开，关键在于色谱柱；色谱泵以恒定流速驱动流动相进入色谱柱从而保证了色 谱分离的过程，所以色谱柱和色谱泵是液相色谱仪的核心。2.1 部分：色谱泵专利的设计一溶剂自动补偿Flexar系列泵是目前世界上唯一能自动进行溶剂压缩性补偿的传输泵，能自动记录 并计量在混合过程中由于溶剂体积收缩而出 现的任何量的变化。当溶剂压缩性改变时， 系统将立即发生作用并自动予以调整。专利 的设计使得每次泵冲程中的任何溶剂混合都 能进行自动溶剂补偿，因此，Flexar系列泵 混合流动相和人工预混合所得出的分析结果 基本一致。独特的设川双柱塞正压吸入式恒流泵，使吸液过程在正 压下进行，
5、从而避免负压吸入空气的可能 性，泵内不易产生气泡。最优的耐压性能全流速范围010mL/min,均可耐压至 6100psi。# |页PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材Perkin Elmer4For tht Better2.2部分：进样器分手动进样器和自动进样器两种图1-5 Flexar自动进样器外观（左）及内部图图1-6六通阀工作示意图图1-6手动进样器六通阀横剖面图# |页Perkin Elmer4FurtAiBEttET手动进样器使用注意事项：手柄不能停留在 Load和Inject中途！否则会暂时堵住了流路， 流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，所以应尽快
6、转动阀。在 HPLC系统中使用平头注射器针头外侧紧贴进样器密封 管内侧，密封性能好，不漏液，不 引入空气；也防止了针头刺坏密封组件及定子。过滤样品溶液，防止微粒阻塞进样阀和减 少对进样阀的磨损。每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流 动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗；进样前，用无纤维纸擦净注射器针头 的外侧。2.3 部分：色谱柱是液相色谱分离的核心，也是液相色谱系统中 最常用的消耗品之一。在使用色谱柱之前，一定要先仔细阅读色谱柱的说明书（不同的色谱柱，使用 要求差距很 大）！不当的使用会 严重缩短色谱柱的寿命！任何色谱柱都有液体流动 方向，不能反用！
7、最 常用的BrownLeeC& C18反相色谱柱通常使用要求：流动相的pH范围：2.57.5；使用 温度：80c以下；操作压力：小于4000psi;保存溶剂：100%甲醇。表1-1色谱柱直径与最佳流速关系色谱柱直径最佳流速1.0mm50uL/min2.1mm200uL/min3.2mm500uL/min4.6mm1.0mL/min图1-7 BrownLee色谱柱的实物图注意：图中色谱柱 方向的箭头，色谱柱不能反方向使用!PerkinElmer*PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材2.4 部分：检测系统 经过分离的组分要选择合适的检测器，才能得到检测。# |页b.测量样品的峰面积或峰高
8、，在校正曲线上查出其对应的百分含量。外标法定量的具 体过程请参考图1-8。整个数据处理过程可以通过PerkinElmer的色谱工作站完 成。c.要求：进样量、色谱分析条件严格不变；增加溶质的浓度 Mi ruesMuteMute配置不同浓度的标液I根据标样的色谱峰面积绘制标准曲线图1-8外标法定量过程4液相色谱样品的制备液相样品制备的基本原则：a溶样溶剂一定是 初始比例的流动相（对等度试验而言，就是流 动相），否则会有溶剂效应或由于样品在流动相中溶 解度不同而析出固体堵塞色谱柱。当 然经过实验考察和证明，其他溶剂也可代替。b采用以下一种或 几种处理方式去除样品中 的不溶物和色谱干扰物：高速离心（
9、大于10,000 rpm） 10分钟后，取上清液 过滤、超 滤选择性沉淀衍生反应液-液萃取固相提取（Solid Phase Extract, SPE其它PerkinElmer4Fm 加 BerterPerkinElmer公司液相色谱现场培训教材第二部分：液相色谱仪标准化操作流程SOP1开机及准备系统2实验打开计算机，运行Chromera软件，在手动控制manual control界面下，设定试验所用的流动相条件、检测波长和其他参数，观察基线，待基线平稳，可准备进样，运行序列 sequence 。具体软件操作，请参考第三部分液相色谱软件（ Chromera ）操作。3关机实验结束后，返回手动控制
10、 manual control界面下，依次进行以下操作：1 .清洗色谱柱约60分钟（详见附录一）2 .冲洗进样器（详见1.4）3 .降低流速至0,待系统压力回零后，退出 Chromera软件，关闭液相各个模块电源。 关闭计算机及显示器电源。Perkin Elmer4PerkinElmer公司液相色谱现场培训教材1.1 开机(Powering On)1.打开Flexar LC各个模块的电源开关至 ON （1）的位置，仪器开始进行自检。2.仪器将进行大约2分钟的自检过程，待仪器自我测试完毕后，每个模块状态栏上出现绿色图2-1 Flexar LCM机状态# |页1.2 准备溶剂(Preparing
11、Solvent Reservoirs)必须用色谱纯有机溶剂（最好选择进口品牌），水或缓冲盐溶液要用超纯水（电阻率大 于18.2M?,总有机碳TOC小于20ppb）;水相流动相需要每隔48小时重新配制，特别是100% 含水流动相的使用时间不得 超过两天；首先要检查所有的管子是否在液面下，必须确保所有的管子全部插到溶剂瓶的底部；洗针1夜（Needle Wash ）的配制：50%甲醇：50%水（该比例仅适用于反相实验 正相试验用流动相）。注意：洗针液中不能含有缓冲盐，否则会破坏进样器的管路*特别提示：所有溶剂和溶液在使用前必须用0.45 m的滤膜过滤，并超声吗;；纯溶剂垂掷的气叟分钟即可,，有机相与
12、水相的混合溶剂需超超声爆气5分钟;用洁净的玻璃容器盛放溶液和流动相,，避免污染；玻璃容器必须使用超纯水清洗；Perkin ： F the BetterPerkinElmer公司液相色谱现场培训教材1.3执行夔灌注(Purge Pump)何时进行琮灌注p100Psi的时候当停泵4个小时以上的时候，或更换流动相的时候，或色谱泵运行时压力脉动大于操作步骤:1 .首先检查确认流动相溶剂的管子在正确的位置，检测器 (Detector)废液管及定量环(Sample Loop )的废液管置于合适的废液容器中。2,摇动溶剂瓶内的过滤器(Solvent Filter),防止气泡附着在过滤器表面。3 ,将空的针筒
13、插入排液阀(Prime/Vent value )中(如图2-2所示)，打开排液阀(以逆时针的方向将排液阀旋转1圈即可灌注启动按键图2-2 Flexar LCM灌注图4 .选择要灌注的流路(例如：流路B),按下相应的泵灌注启动按键，此时色谱泵将以5mL/min的速度排液，然后将针筒向外拉(若管路中没有明显的大段气泡，可以不拉针 筒，液体会自行过来的)，抽出约1520mL 溶剂并完全抽出溶剂管子内的气泡。再次按下该灌注启动按键，色谱泵停止排液。5 .重复上述步骤，对所有要使用的流动相溶剂进行，完成后关闭排液阀门。注意：关闭排液阀门时切不可用力过大，会影响该部件的使用寿命。以色谱泵工作时，该阀门不漏
14、 液为准。PerkinElmer4Fur ttif BetterPerkinElmer公司液相色谱现场培训教材1.4 冲洗进样器(Flash Autosampler)何时执行?？改变溶剂时。发现注射器及其管路内有气泡时O 每天开机和关机的时候。操作涉兼:：1.2.确保洗针液瓶中有洗针液,同时取液管路在液面以下。双击桌面上的Chromera manager图标，登陆相应的仪器系统，进入手动控Run Time制 manual control 状态3. 在冲洗自动进样器Flash Autosampler 处，输入冲洗体积Flush Volume 和冲洗次数Number of Flush Cycles ,并点击一盘丁-二-应用按键，仪器将按所 设参数执行自动冲洗过程。4.在仪器执行自动冲洗过程，请观察 并确保注射器syringe和自动进样器 的管路内无气泡。冲洗进样器耐, 请观察此处是否 有气泡1.5设定流动相觥怫帮i跳渊蛀PerkinElmer4FortAeBsttcrPerkinElmer公司液相色谱现场培训教材操作期骤:1.双击桌面上的Chromera manager图标，登陆相应的仪器系统，进入手动控Run Time制 manual controlj* Mviujri Lntid 广由 Ri1rl状态广2.
