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1、第2讲 微生物的培养与应用考点一 微生物的实验室培养一、基础知识1、培养基（1）营养组成：一般都含有 碳源 、 氮源 、 水 和 无机盐 。 （2）种类：按物理状态分有 固体 培养基（琼脂的作用:作 凝固剂 ）和 液体 培养基； 按功能或用途分有 选择 培养基和 鉴别 培养基。（3）培养乳酸杆菌时需要添加 维生素 ，培养霉菌时需要将培养基pH调为 酸性 ； 培养细菌时需要将pH调为 中性或微碱性 ，培养厌氧微生物时则需要提供 无氧 条件。2、无菌技术：（1）无菌技术的目的是 获得纯净培养物 ，此外还可以防止 感染实验操作者 。 获得纯净培养物的关键是 防止外来杂菌的入侵 ；使用后的培养基丢弃前
2、一定要 灭菌 处理。（2）无菌技术主要通过 消毒 和 灭菌 来避免杂菌的污染。 常用的消毒方法有：煮沸消毒、巴氏消毒、紫外线消毒、化学药剂消毒 。 灭菌的方法：（1）接种环、接种针等接种用具用 灼烧 灭菌，所用器具是 酒精灯 ； （2）玻璃器皿、金属用具可使用 干热 灭菌法，所用器械是 干热灭菌箱 ； （3）培养基、无菌水等使用 高压蒸汽 灭菌法，所用器械是 高压蒸汽灭菌锅 ；二、大肠杆菌的纯化培养：可分成 制备培养基 和 纯化大肠杆菌 两个阶段。1、制备牛肉膏蛋白胨固体培养基（1）操作步骤： 计算 称量 溶化 灭菌 倒平板 。 思考1在称量操作中，动作要迅速，主要是为了防止 防止牛肉膏吸收空
3、气中水分 。 思考2溶化操作中需要不断用玻璃棒搅拌的目的是防止 琼脂糊底而导致烧杯破裂 。（2）倒平板操作：待培养基冷却至 50 左右时在 酒精灯火焰 附近进行操作。2、纯化大肠杆菌 接种微生物常用的方法有 平板划线法 和 稀释涂布平板法，接种工具分别是 接种环 和 涂布器。接种前接种工具都应先 燃烧 灭菌，且待冷却后才接种操作的目的是 以免温度太高，杀死菌种 。 整个接种过程都应在 酒精灯火焰 附近进行。三、菌种保藏的方法1、临时保藏法：放在 4 的冰箱中保藏，主要用于 频繁使用 的菌种。2、甘油管藏法：放在 -20 的冷冻箱中保存，主要用于 长期使用 的菌种。四、简答题思考3平板冷凝后，要
4、将平板倒置的作用是 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可以防 止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染 。思考4每次划线之前都要灼烧接种环的目的是 杀死上次划线后接种环上残留的菌种，使下一次 划线的菌种只来源于上次划线的末端 。思考5划线操作结束时仍需灼烧接种环的目的是 避免接种环上的细菌污染环境和感染操作者 。思考6从第二次划线操作开始，总是从上一次划线的末端开始划线的目的是 使细菌的数目随着 划线次数的增加而逐步减少，最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落 。考点二 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数一、基础知识：1、尿素细菌能合成脲酶 将尿素CO(NH2)2分解为CO2和 NH3 。2、筛选微生
5、物的原理：人为提供有利于 目的菌株 生长的条件，同时 抑制或阻止 其他微生物生长。 例如：培养基中不加入有机物可以筛选 自养型 微生物； 培养基中不加入氮元素，可以筛 选 固氮 的微生物； 加入高浓度的食盐可筛选出 耐盐 的金黄色葡萄球菌。3、统计菌落数目常用方法是 稀释涂布平板法 。【此外还可用 显微镜直接计数 方法测定】 这种方法统计的菌落数往往活菌的实际数目 低 。为了保证结果准确，选择菌落数在 30300 的平板进行计数，且每个稀释浓度涂布 3 个平板，再取平均值。4、排除培养基是否被污染的方法：相同条件下培养没有接种微生物的空白培养基看是否有菌落生成。二、实验设计1、土壤取样时一般要
6、先铲去 表层土 ，取样用的器具使用前都需要 灭菌 。2、样品的稀释：不同微生物的稀释倍数 不同 。3、微生物的培养与观察：放在 恒温箱 中培养，选取菌落数目 稳定 时的记录作为结果。4、鉴定：在以尿素为唯一氮源的培养基中加酚红 指示剂变 红 色。 统计细菌数目的其它方法: 滤膜法 ，将大肠杆菌接种到 伊红美蓝 培养基中菌落呈 黑 色。考点三 分解纤维素微生物的分离一、基础知识： 1、纤维素酶是一种 复合酶 ，它至少包括三种组分：C1酶、CX酶 和 葡萄糖苷酶 。2、纤维素分解菌的筛选（1）方法： 刚果红 染色法。（2）原理：刚果红（CR）可以与纤维素形成 红色复合物 ，但并不与被 纤维素酶 分
7、解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应。当培养基中的纤维素被分解后，会出现以 纤维素分解菌 为中心的 透明圈 ，我们可以通过是否产生 透明圈 来筛选纤维素分解菌。 方法一：先培养微生物，再用刚果红染色；【加入NaCl溶液的作用是将结合不牢固的刚果红洗去】方法二：在倒平板时就加刚果红染色。二、实验设计思考1选择培养的目的 增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离到所需的微生物 。思考2选择培养的操作是：将培养瓶固定在摇床上 振荡培养 ，直至培养液变 混浊 。思考3为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？答：因为只有能适应这种营养条件的微生物才能繁殖，而其它微生物的繁殖被抑制。 课题延伸：为了确
8、定分离得到的是纤维素分解菌，还需要进行 发酵产纤维素酶 的实验，纤维素酶的发酵方法有 液体 发酵和 固体 发酵。单元检测1、某实验小组欲从豆油污染的土壤中筛选出能高效降解脂肪的菌株。请回答：（1）在筛选过程中，应将土壤样品稀释液接种于以 为唯一碳源的固体培养基上，从功能上讲，该培养基属于 培养基。（2）为避免培养皿污染，需将培养皿呈 状态放置。为避免培养液中菌体浓度过高，需将培养液进行 处理。为了排除 ，需设置接种等量 的培养基作为空白对照。（3）为了筛选出菌株，可将适量的 试剂滴加在平板中的菌落周围，洗去浮色后，如果菌落周围的现象是 ，则说明此种菌能够分泌脂肪酶。（4）通过纯化培养得到的菌种
9、应放在 中保存，以便长期使用。2、每生物兴趣小组为了探究土壤中的微生物对尿素是否有分解作用，设计了以下实验，并成功筛选到能高效降解尿素的细菌（目的菌）培养基成分如下表所示，实验步骤表格所示请分析回答问题：KH2PO41.4gNa2HPO42.1gMgSO47H2O0.2g葡萄糖1g尿素10g琼脂15g将上述物质溶解后，用蒸馏水定容到1 000mL（1）土壤中分解尿素的细菌的鉴定方法及原理：在以尿素为唯一氮源的培养基中加入 指示剂，细菌合成的 将尿素分解为 ，导致pH升高，使指示剂变为红色（2）培养基中加入琼脂的作用是 。加入尿素的目的是筛选目的菌，从这个角度分析这种培养基属于 培养基。（3）“
10、目的菌”生长所需的碳源来自培养基中的 ，实验中需要振荡培养，原因是 。（4）图1是利用 法进行微生物接种，所用的接种工具是 。关于图1的操作方法和结果，叙述正确的是 A除第一次外，每次划线都要从上次划线的末端开始B每次次划线前后都要对接种工具灭菌，且目的相同C整个接种划线操作都要在酒精灯火焰旁进行D接种完成后需放在恒温培养箱中培养，且皿盖在上3、某实验小组为了研究pH对纤维素分解菌产生的纤维素酶活性的影响，将纤维素分解菌分别接种在pH不同的刚果红纤维素培养基中，通过观察出现透明圈的最早时间和24 h后透明圈直径的大小来判断纤维素酶活性的高低，实验流程如图乙所示：土壤取样选择培养梯度稀释接种至不
11、同pH刚果红纤维素培养基中（1）纤维素酶是一种复合酶，其中_能将纤维二糖分解为葡萄糖。从土壤中筛选出分解纤维素的微生物的方法叫_染色法。（2）实验流程中，选择培养的目的是_。选择培养基中应该加入 _作为唯一的碳源，另外还要加入的基本营养物质有_。（3）为了说明选择培养基对纤维素分解菌起到了选择的作用，应怎样设置对照实验？ _。（4）根据流程图可知，将纤维素分解菌接种到培养基上所用的方法为_。本实验中该接种方法所用的培养基从物理状态看，属于_培养基。（5）该实验小组设置了pH分别为6、7、8的三组实验进行观察，得到了如下的实验结果：pH出现透明圈的最早时间(h)24h后透明圈的直径(cm)664
12、.427103.668241.33 通过上述结果可知，该实验的自变量是_，纤维素分解菌更适合在偏_ (填“酸”、“碱”或“中”)性环境下生长。参考答案：1、（1）豆油 选择 （2）倒置 系列稀释（或“梯度稀释”） 无菌水 实验组中非测试因素对实验结果的影响（培养基被污染）（3）苏丹（或“苏丹”） 出现透明圈（不出现红色圈或橘黄色圈） （4）-20的冷冻箱2、（1）酚红 脲酶 氨 （2）作凝固剂 选择（3）尿素 葡萄糖 为目的菌提供氧气（4）平板划线 接种环 AC3、（1）葡萄糖苷酶 刚果红 （2）增加纤维素分解菌的数量 纤维素 氮源、水和无机盐（3）将培养基中的纤维素改为葡萄糖，其他条件相同 （4）稀释涂布平板法固体 （5）pH 酸3
