PCR扩增的原理和操作步骤

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1、PCR 扩增反应的操作第一节 PCR 扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR ）的基本构成PCR 是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定 模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程， 在体外特异性扩增 DNA 片段的一种技术，在分子生物学中有广泛的应 用，包括用于DNA作图、DNA测序、分子系统遗传学等。PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3 末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环 能使微量的模板 DNA 得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与 待扩增的 DNA 片段两端已知序列分别互补的两个引物、适

2、量的缓冲 液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热TaqDNA聚合酶、Mg2等。 反应时先将上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单 链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对， 形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在 TaqDNA 聚合 酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿5-3方向延伸，形成新的 DNA 片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度， 由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的 基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引 物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图

3、）。1模板 DNA 的变性模板DNA加热到9095C时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成 为单链，称为 DNA 的变性，以便它与引物结合，为下轮反应作准备。 变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间 只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高 些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复 杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中 需添加一定量二甲基亚砜（DMSO）,并且在PCR循环中起始阶段热变 性温度可以采用97C，时间适当延长，即所谓的热启动。2模板 DNA 与引物的退火将反应混合物温度降低至3

4、765C时,寡核苷酸引物与单链模板杂 交，形成 DNA 模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引 物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要求引物的浓 度大大高于模板 DNA 的浓度，并由于引物的长度显着短于模板的长 度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间 重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为l2min。3引物的延伸DNA 模板-引物复合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以 dNTP 为反应 原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模 板 DNA 链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更 多的“半保留复制链”，而

5、且这种新链又可成为下次循环的模板。延 伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72C条件下，TaqDNA聚 合酶催化的合成速度大约为 4060 个碱基/秒。经过一轮“变性-退 火-延伸”循环，模板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成 的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加 一倍。每完成一个循环需24min, 次PCR经过3040次循环， 约23h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚 合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台 效应”即靶DNA产物的浓度不再增加。PCR 的三个反应步骤反复进行，使 DNA 扩增量呈指数上升。反 应最

6、终的DNA扩增量可用Y=（l+X）n计算。Y代表DNA片段扩 增后的拷贝数，X表示平（Y）均每次的扩增效率，n代表循环次数。 平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理 论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产 物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增 长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、 PCR 扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等 因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。PCR 扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片 段的长度严格地限定在两个引物链 5端之间，是需要

7、扩增的特定片 段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成 的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的 DNA 为模板，引物是从 3端开始延伸，其 5端是固定的， 3端则没有固定 的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物 除与原始模板结合外，还要同新合成的链（即“长产物片段”）结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的 5端序列是固定的，这就等于 这次延伸的片段 3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限 定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出 “短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数 增加，几乎可以

8、忽略不计，这使得 PCR 的反应产物不需要再纯化， 就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。】. f Wil啊!图 PCR 的反应历程! iT7 !； mPi 1 .nTPIir rTliTrminPCR 反应的五个元素参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+1引物引物是PCR特异性反应的关键,CR产物的特异性取决于引物与模 板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能 按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外 大量扩增。引物设计有3条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密 互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结

9、构，再次 引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值 这个和扩增物产量有关的重要物理参数。好的引物设计可以避免背景 和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模 板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物 将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应 指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应 条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、 甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR 的成功，但遵循某些原则，

10、则有助于引物的设计。（1）引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp,常用的是18 27bp，但不应大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对； 引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74C，不适 于TaqDNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。（2）引物碱基构成引物的G+C含量以4060%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不 能相差太大。其 Tm 值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下， 50%寡核苷酸双链解链的 温度，有效启动温度，一般

11、高于Tm值510C。若按公式Tm=4 （G+C） +2 （A+T）估计引物的 Tm值，则有效引物的Tm为5580C，其Tm值最好接近72C以使复性条件最佳。引物中四种 碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌吟或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C， 因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。（3）引物二级结构 引物二级结构包括引物自身二聚体、发卡结构、引物间二聚体等。这些因素会影响引物和模 板的结合从而影响引物效率。对于引物的3末端形成的二聚体，应控制其AG大于-5.0kcal/mol或 少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物 中间或5端的要

12、求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3 端或近3 端对引物-模板结合影 响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大 的关系。应尽量避免3末端有发卡结构的引物。（4）引物 3端序列 引物3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3末端最后5到6 个核苷酸的错配应尽可能的少。如果 3末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错 配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物3 末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3 末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是

13、引物自身的 扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。引物3末端的稳定性由引物3末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的AGo ?G值是 指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩 增有较大的影响。应当选用3端?G值较低（绝对值不超过9），负值大，则3末端稳定性高，扩增 效率更高。引物的3端的?G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。需要注意的是，如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位 易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱

14、基， 因此应当避免在引物的3端使用碱基Ao（ 5）引物的 5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响 扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu3+等；引入蛋白 质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两 个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目 的基因的克隆工作中。（6）引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续 8 个互补碱基同源，特别是与待扩增 的模板DNA之间要没有明显的相似序列。2酶及其浓度TaqDNA

15、多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermusaquaticus）中分离的。TaqDNA 聚合酶是一个单亚基，分子量为94000Da。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力， 无3-5的外切核酸酶活力，会在3末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A,故PCR产 物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，TaqDNA聚合酶的出错率为10-410-5。此酶的发 现使PCR广泛的被应用。此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70C下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93下反应2小时后其残 留活性是仍能保持60%,而在95C下反应2小时后为原来的40%。（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0kb，且特异性也较高。PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩 增的酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针对不同实 验对象的酶等。一典型的PCR反应约需的酶量为2.5u （总反应体积为50?1时），浓度过高可引起非特异性扩 增，浓度过低则合成产物量减少。3. dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去 生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配