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1、4-17二磷酸核酮糖羧化/加氧酶(Rubisco)羧化活性的测定核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶 (EC 4.1.1.39) 是光合作用中的一个 关键酶，它在Calvin循环中催化CO2的固定，生成二分子的3-磷酸甘油酸(3-PGA), 同时它是一个双功能酶，又能催化将02加在核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)的C-2位 置上生成一分子的磷酸乙醇酸和一分子的 3-磷酸甘油酸，这两个反应的速率由 o2和co2浓度调节。Rubisco 羧化活性的测定一般通过测定从 NaH14CO3 生成酸稳定的1-i4C-3-PGA的速率来进行，也可以用酶偶联法将3-PGA的变化转变为NADH 来测定。其
2、原理如下：RuBP + CO2 + H2O Rubisco+Mg2+. 2 X 3-磷酸甘油酸3-磷酸甘油酸+ ATP磷酸甘油酸激酶+ Mg2+* 1,3-二磷酸甘油酸+ ADP1,3-二磷酸甘油酸+ NADH3-磷酸甘油醛脱氢酶 3-磷酸甘油醛+ NAD+ H+ PO4-3从以上反应计算一分子RuBP的羧化就有两分子的NADH被氧化，这样就可以 用紫外分光光度计在340 nm测NADH的减少来计算酶活力。1仪器设备 液体闪烁计数器、烘箱、水浴锅、研钵或组织捣碎机、分光光度计等2 操作方法2.1 Rubisco 的提取及纯化211植物粗提液的制备 称约X g叶片加入X ml预冷到4C提取缓冲液
3、(Tris-HCl pH 7.8 100 mmol/L, KCl 20 mmol/L, EDTA 1 mmol/L)中匀浆，15000g 离 心10 min取上清液备用。212 酶的纯化 将上述得到的粗提液用 40%饱和度的硫酸铵进行分部，8000 g, 在4C冷冻离心20min。然后取上清液加硫酸铵至70%的饱和度，10000g,冷冻 离心20 min后取沉淀，用少量重悬缓冲液(25 mmol/LTris-HCl pH7.& 1 mmol/L EDTA, 5 mmol/L 巯基乙醇，20 mmol/L KCl)溶解，再经 Sephadex G-25 脱盐后上 DEAE (DE52)柱，用含0
4、-0.5 mol/L NaCl的重悬缓冲液进行梯度洗脱，收集0.25 mol/L NaCl分部。70%硫酸铵沉淀保存于-20C，待测活性前以2 mg/ml溶于重 悬缓冲液中备用。22 同位素测定法2.2.2酶活性的测定操作 在460 ul测定反应液(Tris-HCl pH8.2 100 mmol/L, NaH14CO3 ( 0.2 u Ci/ u mol) 10 mmol/L，MgCl2 20 mmol/L，DTT 1 mmol/L)中， 加入20 ul酶液(2 mg/ml)，混匀后在25 C保温10-20 min， 加入20 u l RuBP 储存液(10 mmol/L pH 6.5)起始反
5、应，0.5-1 min 后加入 200 u l 的 HCl (2 mol/L) 终止反应。取500 ul在闪烁计数杯中烘干以去除CO2,最后加入0.5 ml水和4.5 ml 闪烁液(PPO 8.5 g, POPOP 0.5 g, TritonX-100 0.5 1,甲苯 1.0 1),进行液闪计 数。活力计算方法如下：羧化酶活力(口 mol/min/mg 蛋白)14 C (dpm)/(dpm 14C/ 口 mol CO2)/时间 (min)/蛋白量(mg)2.2.3 初始活性和总活性的测定 Rubisco 在体内的含量很高,但它的活性很低,许多实验表明这是由于体内的酶只有一部分是活化的。可用下
6、面的图来表示Rubisco 活化过程：钝化 活化 ER E(ECM)(ECM)R(ECM)R=t (ECM) + PRC&MRCR = RuBPC = CO2 M = Mg2+P = 产物Rubisco 在体内的活化状态与植物的生理状态有很大的关系,它的活化状态可用 活化率来表示。Rubisco的活化率为其初始活性除以总活性再乘以100。(1) 初始活性的测定 将20 ul植物材料初提液直接加到480 ul的反应液(内含 0.4 mmol/L RuBP)中。在 25 C 保温 0.5-1 min 后，力口 200 u l HCl (2 mol/L)终止 反应。以下步骤及活性计算与上所述相同。(
7、2) 总活性的测定 将20 ul植物材料粗提液加入460 ul反应液中，在25C保温 1020 min充分激活后，加入20 u l RuBP后起始反应。0.5-1 min后用HCl终止 反应。以下步骤与初始活性的测定相同。(3) Rubisco活化率计算 Rubisco活化率=初始活性/总活性X 1003.2 偶联酶测定法3.2.1 酶的活性测定 在 2.7 ml 反应液(Tris-HCl pH8.2 100 mmol/L, NaHCO310 mmol/L， MgCl220 mmol/L， DTT 1 mmol/L NADH 0.5 mmol/L,ATP 5 mmol/L，) 中加入100 u
8、 l活化过或未活化过的蛋白(2 mg/ml)。然后加入100 u三磷酸甘 油激酶/三磷酸甘油醛脱氢酶(1:1),在340 nm测光吸收为E,最后加入1001! RuBP,立刻每隔15 s至30 s间隔测定光吸收变化为E。3.2.2酶的活力计算 Rubisco 酶活力(umol/min/mg 蛋白)=(aAXV)/ (2 dXg XtX酶的总量)a为E0 -E1 , V为反应总体积(3ml), d为比色杯光径，g为1 u mol NADH 在340 nm的消光系数，为E。到E1的时间(min)。3.3 注意事项3.3.1 RuBP很不稳定，特别是在碱性环境下，因而使用不超过24星期，且因在 pH
9、 5-6.5 之间以 10 mmol/L 保存于-20C。3.3.2三磷酸甘油酸激酶和三磷酸甘油醛脱氢酶可从Sigma等公司购买，也可按Scopes(1969)方法从兔子肌肉中提取。陈根云)4-18二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)加氧活性的测定核酮糖-1,5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶 (EC 4.1.1.39) 是光合作用中的一个关键酶，它是一个双功能酶不仅在Calvin循环中催化CO2的固定，而且能催化 将02加在核酮糖-1,5-二磷酸(RuBP)的C-2位置上生成各一分子的磷酸乙醇酸和 3-磷酸甘油酸。Rubisco加氧反应是典型的单加氧反应，RuBP的加氧反应中，将 02的两
10、个氧原子分别掺入到h2o和磷酸乙醇酸中。因而加氧酶的活性可用氧电 极法以氧的消耗来确定。而RuBP在有Mn2+离子参与的酶的加氧反应中首先被 烯醇化，这时RuBP的C2位置被调整为一个负碳离子，当与分子氧反应后形成 过氧化离子，然后该中间产物中的电子又从氧回到烯醇化的RuBP再生成负碳离 子并产生单线态氧。而这单线态氧可以利用发光光度计来检测。发光光度计法测 定加氧酶活性比氧电极法灵敏度高 70倍，可在研究中作相对比较。但如果要测 定酶加氧活性的绝对值，则要用氧电极法先行标定。1仪器设备氧电极测氧装置、FG300型发光光度计(中科院上海植生所制)、冷冻离心 机、组织捣碎机等。2 操作方法2.1
11、 酶的提取与纯化Rubisco 的提取与纯化同 4-17中的方法，使用时以 8mg/ml 来溶解。2.2 氧电极测定法2.2.1 溶氧量的标定 将 2 ml 反应液(Tris-HCl 100 mmol/L pH 8.2, EDTA 0.4 mmol/L, MgCl220 mmol/L)加入反应室，25C，在大气中搅拌10 min，使溶液中 的溶解氧与大气平衡。然后把电极放在反应室上，调节测氧仪的灵敏度旋钮，使 记录仪至满刻度，再加入0.1 ml饱和的亚硫酸钠，除尽水中的氧，指针退回到接 近0点，根据指针退回的格数和25C水的溶解氧量，就可以计算出每格记录纸 所代表的氧量。25C时的水的溶氧量为
12、0.26 口 mol/ml。每格记录纸代表的溶氧 量计算如下：N ( 口 mol O2/ 1格记录纸)=0.26 口 mol氧/ml X溶液体积/指针退回的格 数2.2.2活力测定2 ml空气饱和的溶液加入反应室，加入0.1 ml酶液(8 mg/ml), 在25C保温10 min后，装好电极，记录由DTT氧化所消耗的氧为空白速度，最 后加入0.01 ml RuBP储存液(10 mmol/L pH 6.5)开始反应，记录反应速度,反应速 度以每分钟多少格子记录纸来表示。加氧酶的活力就可通过以下公式计算：加氧酶活力(口 mol O2/min/mg)= N X (加酶后的反应速度-空白速度)/酶 的
13、总量 (mg)2.3 发光光度计测定法2.3.1测定方法 先在比色杯中加入25 口 l RuBP储存液，放入发光光度计反应暗 室中，然后将 1.4 ml 反应液(Tris-HCl 50 mmol/L pH 8.0, MnCl2 1.0mmol/L, NaHCO31.0 mmol/L)中加有10 口 l酶液的混合液在25C保温10 min,然后注射 入比色杯开始反应，自动记录发光曲线。发光强度为任意单位，以峰高来表示 (mm)。2.4 附录Rubisco有关的酶动力学常数表(30C, pH8.2)Kcat(COJKcat(Mg2+)Kmg)Km(COJ*KmQJ*Km(RuBP)100ymol1000mol10-15 mol26ymol400pmol20-25mol*以空气中的CO2和O2来计算的Km值(陈根云)340 nm NADH 摩尔消光系数：6220 L/cm/mol
