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1、word摘要：现在最常用的两种分析实时定量PCR 实验数据的方法是绝对定量和相对定量。绝对定量通过标准曲线计算起始模板的拷贝数；相对定量方法如此是比拟经过处理的样品和未经处理的样品目标转录本之间的表达差异。2CT方法是实时定量PCR 实验中分析基因表达相对变化的一种简便方法，即相对定量的一种简便方法。本文介绍了该方法的推导，假设与其应用。另外，在本文中我们还介绍了两种2CT衍生方法的推导和应用，它们在实时定量 PCR 数据分析中可能会被用到。关键词：反转录PCR 定量PCR 相对定量 实时PCR Taqman反转录 PCR RT-PCR 是基因表达定量非常有用的一种方法1 - 3 。实时PCR
2、 技术和RT-PCR 的结合产生了反转录定量 PCR 技术4,5 。实时定量 PCR 的数据分析方法有两种：绝对定量和相对定量。绝对定量一般通过定量标准曲线来确定我们所感兴趣的转录本的拷贝数；相对定量方法如此是用来确定经过不同处理的样品目标转录本之间的表达差异或是目标转录本在不同时相的表达差异。绝对定量通常在需要确定转录本绝对拷贝数的条件下使用。通过实时 PCR 进展绝对定量已有多篇报道6 - 9 ，包括已发表的两篇研究论文10,11 。在有些情况下，并不需要对转录本进展绝对定量，只需要给出相对基因表达差异即可。显然，我们说 X 基因在经过某种处理後表达量增加 2.5 倍比说该基因的表达从10
3、00 拷贝/ 细胞增加到2500 拷贝/ 细胞更加直观。用实时PCR 对基因表达进展相对定量分析需要特殊的公式、假设以与对这些假设的验证。2CT方法可用于定量PCR 实验来计算基因表达的相对变化：2CT公式的推导，以与实验设计，有效性评估在Applied Biosystems User Bulletin No.2P/N4303859中有介绍。用2CT方法分析基因表达数据在文献中也有报道5,6。本文介绍了该方法的推导、假设以与应用。另外，本文还介绍了2CT两种衍生方法的推导和应用，它们在实时定量PCR 数据分析中都可能被用到。1. 2CT方法1.1. 2CT方法的推导PCR 指数扩增的公式是：这
4、里，Xn 是第 n 个循环後目标分子数，X0 是初始目标分子数，Ex 是目标分子扩增效率，n 是循环数，C T 代表目标扩增产物达到设定阈值所经历的循环数。因此：X T 是目标分子达到设定的阈值时的分子数。C T,X 是目标分子扩增达到阈值时的循环数。Kx 是一个常数。对于内参反响而言，也有同样的公式：用XT 除以RT 得到：对于使用 Taqman 探针的实时扩增而言， XT 和 RT 的值由一系列因素决定：包括探针所带的荧光报导基团、探针序列对探针荧光特性的影响、探针的水解效率和纯度以与荧光阈值的设定。因此常数K 并不一定等于1 。假设目标序列与内参序列扩增效率一样：或：XN 代表经过均一化
5、处理过的初始目标分子量；CT表示目标基因和内标基因CT值的差异CT,XCT,R 整理上式得：最后用任一样本q 的XN 除以参照因子calibrator, cb的XN得到：在这里对于一个少于150bp 的扩增片断而言，如果 Mg2+ 浓度、引物都进展了适当的优化，扩增效率接近于1 。因此目标序列的量通过内均一化处理之后相对于参照因子而言就是1.2. 2CT方法的假设和应用要使CT计算方法有效，目标序列和内参序列的扩增效率必须相等。看两个反响是否具有一样的扩增效率的方法是看他们模板浓度梯度稀释後扩增产物CT如何变化。图1 显示的是 cDNA 样品在 100 倍稀释X围内的实验结果。对于每一个稀释样
6、本，都用GAPDH 和c-myc 特异的荧光探针与引物进展扩增。计算出c-myc 和 GAPDH 的平均CT值以与CT值，通过cDNA 浓度梯度的log值对CT值作图，如果所得直线斜率绝对值接近于0，说明目标基因和内标基因的扩增效率一样，就可以通过CT方法进展相对定量。在图1中，直线斜率是0.047，因而假设成立，CT方法可以用来分析数据。如果两个扩增反响效率不同，如此需要通过定量标准曲线和绝对定量的方法来进展相对定量；或者也可以重新设计引物，优化反响条件使得目标序列和内参序列具有一样的扩增效率。1.3. 2CT内标和参照因子的选择使用内标基因的目的是为了对参加到反转录反响中的RNA 进展均一
7、化处理。标准的看家基因一般都可被用作内标基因。适合于实时 PCR 反响内标基因包括GAPDH， -actin，2-microglobulin 以与rRNA 。当然，其它的看家基因也同样能被用作内标。我们推荐在应用某一基因作为内标之前首先确证该基因的表达不会受实验处理的影响。验证实验处理是否对内标基因表达产生影响的方法在2.2 局部有描述。2CT方法中参照因子的选择决定于基因表达定量实验的类型。最简单的设计就是把未经处理的样品作为参照因子calibrator 。经内标基因均一化处理後，通过方法计算，目标基因表达差异通过经过处理的样本相对于未经处理的样本的倍数来表示。对于未经处理的参照样，CT=0
8、，而20=1。所以根据定义，未处理样本的倍数变化为1 。而对于那些经过处理的样本，相对于参考因子基因表达的倍数为2CT。同样的分析也可用于不同时相的基因表达差异，在这种情况下，一般选0 时刻的样本作为参照因子。有些情况下，并不是比拟不同处理样本基因表达差异。例如，有的是想看某一器官中特定 mRNA 的表达。在这种情况下，参照因子可能是另一器官中该 mRNA 的表达。表1显示了大脑和肾脏总RNA 中c-myc 和GAPDH 转录本的CT 值。在这一个例子中，大脑被人为的选择为参照因子，通过计算得到肾脏c-myc 表达量经GAPDH 校正後相对于大脑的表达量的结果。尽管相对定量方法可用于这种组织之
9、间的比拟，但结果的生物学解释是相当复杂的。不同种类细胞中目标和参照转录本单一的相对量变化可能在任何特定的组织中都存在。表 1 给出了目标基因c- myc 和内参基因GAPDH 在不同管中扩增的实验数据。在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比拟，而应该分别计算出 c-myc 和 GAPDH 的平均CT 来计算CT 。1.4. 2CT方法的数据分析实时定量PCR所得到CT值可以很容易的输出到表格程序如Microsoft Excel中去。为了显示数据分析过程，我们在这里给出了一个基因表达定量的实验数据和样本列表。通过-actin 均一化处理，我们对目标基因fos-glo-
10、myc 的表达变化进展了监测。在8h 的时间X围内，在每一时间点都取3 个重复样本，每一样本在cDNA 合成之後都做定量PCR ，数据分析用到了公式9，即：Time x 表示任意时间点，Time 0表示经 -actin 校正后1 倍量的目标基因表达。0 时刻目标基因和内标基因的平均CT见图2 第8 栏被用于公式9 中。通过公式9 计算出每一个样本目标基因表达通过 -actin 均一化处理後相对于0 时刻的倍数见图2 第9 栏。平均SD，CV 由每一个时间点所取的三个重复样求得。用这种分析方法，在0 时刻的平均倍数变化接近于1。我们发现通过检测在 0 时刻平均倍数变化是否为1 可以很方便的验证三
11、个重复样品之间是否有错误或者误差。如果得到的结果与1偏差很大，如此明确存在计算错误或者是很高的实验误差。在前面的例子中，在每一时间点上分别取了三个独立的 RNA 样本进展了分析。因此对每一个样本分别处理，通过计算後取结果的平均值就非常重要。如果是同一样本进展 PCR 扩增的重复，这就需要首先求出平均CT，然後再进展 计算。怎么样计算平均值就要看目标基因和内参基因是在同一个管子中扩增还是在不同的管子中扩增。表 1 给出了目标基因c- myc 和内参基因GAPDH 在不同管中扩增的实验数据。在这里不应该把任一单个的 c-myc 管子和 GAPDH 管子作比拟，而应该分别计算出 c-myc 和 GA
12、PDH 的平均CT 来计算CT 。重复实验中CT值的估计偏差通过标准的指数计算转化成最後结果中相对量的变化。但其中的一个难点是 CT值与相应的拷贝数成指数关系见第4 局部，因此，在最後的计算中，的误差通过CT 加上标准偏差和CT 减去标准偏差来评估，这就使得求得的数值相对于平均值呈不对称分布。不对称分布是因为结果经指数处理後转化成量的线性比拟造成的。通过不同荧光染料标记的探针，我们可以在同一管中同时扩增目标序列和内标序列。表2 给出了目标基因c- myc和内标基因GAPDH在同一管中扩增的实验数据。对于任意一个管子，目标基因c- myc和内参基因GAPDH扩增时参加的cDNA 量都是一样多的，
13、所以可以分别对每个管子计算CT 值，这些值取平均后再进展计算。 在这里估计误差值也是一个不对称的X围，反映了误差经指数处理转化为线性差异。在表1 和表2 中，估计误差在从CT 到CT 的计算中未见有增加，这是因为我们把参照基因和检测基因的误差都显示出来了。我们把CT，cb 当作一个人为设定的常数来减去，得到CT 。这样得到的结果就与图 2 所显示的在求平均之前对不同重复样本分别通过各自的CT 值某某 所得结果 相当。另一种方法是将参照基因当作没有任何误差的1倍的量，在这种情况下，平均CT,cb 的误差值被引入到每一样本的CT中。在表1中，肾脏中CT 变成- 2.500.20 而经过校正的c-m
14、yc 量是5.6 倍，X围从4.9 到 5.6 。而在大脑中的结果是没有误差的1倍。表2 给出了目标基因c- myc和内标基因GAPDH在同一管中扩增的实验数据。2. 2Cf方法2.1. 2Cf方法的推导通过内标RNA 可以对参加 RNA 的量的差异进展校正。2CT方法的数据分析的一个特点就是能够利用实时PCR 实验的一局部数据来完成这种校正。在其它的方法不能定量初始 RNA 量的时候：例如，在能得到的 RNA 量非常有限的时候或者需要处理高通量的样品的时候，这一方法的优势就格外明显。当然我们也可以利用PCR 实验以外的方法来完成这种校正。最常用的一种方法就是用紫外吸收来确定用于cDNA 合成
15、的RNA 量，然後将一样的RNA 反转录产生的cDNA 用于PCR 定量反响。这种外标法校正的一个应用例子就是研究某种实验处理是否影响内标基因的表达。在这里，目标基因和内标合二为一。在这个例子中，公式2 不被公式3 除，公式5 变成：整理得：任一样品X0,q 除以参照品X0,cb 得：在这里 CT=CT,q-CT,cb 。CT与前面计算中用的CT用目标基因CT值减去参照基因CT值相互区别。就象在1.1局部所描述的，如果条件优化较好，效率接近于1，内标相对于参照因子为：2.2. 2Cf方法的应用2CT方法的一个应用就是确定实验处理对某一候选内标基因的影响。为了显示这一过程，我们做了血清饥饿/ 诱导实验7 。血清饥饿/ 诱导是研究某些 mRNA 降解的常用方法8。然而，血清可能影响一些基因的表达包括标准的看家基因的表达。在24-h 血清饥饿培养之後，在NIH 3T3 细胞中参加15% 血清诱导基因表达。从细胞中提取Poly(A)+ RNA ，并将之反转录成cDNA 。利用SYBR Green 通过实时定量PCR 检测GAPDH ， 2 -microglobulin cDNA 的量。GAPDH 和2 -microglobulin 各自的相对量通过
