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1、最近我也在设计引物，也简单谈一下用primer5和oligo使用的基本技巧 一、Primer Premier 5.0 的使用技巧简介1. 功能“Premier”的主要功能分四大块，其中有三种功能比较常用，即引物设计、限制性内切酶位点分 析和DNA基元(motif)查找。“Premier”还具有同源性分析功能，但并非其特长，在此略过。此 外，该软件还有一些特殊功能，其中最重要的是设计简并引物，另外还有序列 朗读”、DNA与 蛋白序列的互换、语音提示键盘输入等等。有时需要根据一段氨基酸序列反推到DNA来设计引物，由于大多数氨基酸(20种常见结构氨 基酸中的18种)的遗传密码不只一种，因此，由氨基酸
2、序列反推 DNA序列时，会遇到部分 碱基的不确定性。这样设计并合成的引物实际上是多个序列的混和物，它们的序列组成大部分相 同，但在某些位点有所变化，称之为简并引物。遗传密码规则因物种或细胞亚 结构的不同而异， 比如在线粒体内的遗传密码与细胞核是不一样的。“Premier”可以针对模板DNA的来源以相应的 遗传密码规则转换DNA和氨基酸序列。软件共给出八种生物亚结构的不同遗传密码规则供用 户选择，有纤毛虫大核(Ciliate Macronuclear)、无脊椎动物线粒 体(Invertebrate Mitochondrion)、支原体(Mycoplasma)、植物线粒体(Plant Mitoch
3、ondrion)、原生动物线 粒体(Protozoan Mitochondrion)、一般标准(Standard)、脊椎动物线粒体(Vertebrate Mitochondrion)和酵母线粒体(Yeast Mitochondrion)。2. 使用步骤及技巧“Premier”软件启动界面如下：其主要功能在主界面上一目了然(按钮功能如上述)。限制性酶切点分析及基元查找功能比较简 单，点击该功能按钮后，选择相应的限制性内切酶或基元(如-10序列，-35序列 等)，按确 定即可。常见的限制性内切酶和基元一般都可以找到。你还可以编辑或者添加新 限制性内切酶 或基元。进行引物设计时，点击按钮，界面如下：
4、进一步点击按钮，出现search criteria”窗口，有多种参数可以调整。搜索目 的(Seach For)有 三种选项，PCR 引物(PCR Primers)，测序引物(Sequencing Primers)，杂交探针(Hybridization Probes)o搜索类型(Search Type)可选择分别或同时查找上、下游引物(Sense/Anti-sense Primer， 或Both )，或者成对查找(Pairs )，或者分别以适合上、下游 引物为主(Compatible with Sense/Anti-sense Primer )。另外还可改变选择区域(Search Ranges
5、)，引物长度(Primer Length)， 选择方式(Search Mode )，参数选择(Search Parameters )等等。使用者可根据自己的需要 设定各项参数。如果没有特殊要求，建议使用默认设置。然 后按，随之出现的Search Progress 窗口中显示Search Completed时，再按，这时搜索结果以表格的形式出现，有三种显示方式， 上游引物(Sense)，下游引物(Anti-sense)，成对显示(Pairs)。默认显示为成对方式，并按优劣 次序(Rating )排列，满分为100，即各指标基本都能达标(如下图)。点击其中一对引物，如 第1#引物，并把上述窗口挪开
6、或退出，显示“Peimer Premier主窗口，如图所示：该图分三部分，最上面是图示PCR模板及产物位置，中间是所选的上下游引物的一些 性质，最 下面是四种重要指标的分析，包括发夹结构(Hairpin )，二聚体(Dimer )，错误引发情况(False Priming )，及上下游引物之间二聚体形成情况(Cross Dimer )。当所分析的引 物有这四种结 构的形成可能时，按钮由变成，点击该按钮，在左下角的窗口中就会出现该结构的形成情况。一 对理想的引物应当不存在任何一种上述结构，因此最好的情况是最下面的分析栏没有，只有。 值得注意的是中间一栏的末尾 给出该引物的最佳退火温度，可参考应用
7、。在需要对引物进行修饰编辑时，如在5端加入酶切位点，可点击，然后修改 引物序列。若要回 到搜索结果中，则点击按钮。如果要设计简并引物，只需根据源氨基酸序列的物种来源选择前述的八种遗传密码规则，反推至DNA序列即可。对简并引物的分析不需像一般引物那样严格。总之，“Premier”有优秀的引物自动搜索功能，同时可进行部分指标的分析，而且容易使用，是 一个相当不错的软件。二、Oligo 6.22使用技巧简介1. 功能在专门的引物设计软件中，“Oligo”是最著名的。它的使用并不十分复杂，但初学者容易被其复 杂的图表吓倒。Oligo 5.0的初始界面是两个图：Tm图和AG图；Oligo 6.22的界面
8、更复杂， 出现三个图，加了个Frq图。“Oligo”的功能比“Premier”还要单一，就是引物设计。但它的引物 分析功能如此强大以至于能风靡全世界。2. 使用（以Oligo 6.22为例）Oligo 6.22的启动界面如下：图中显示的三个指标分别为Tm、AG和Frq，其中Frq是6.22版本的新功能，为邻近6至7个 碱基组成的亚单位在一个指定数据库文件中的出现频率。该频率高则可增加错误引发的可能性。 因为分析要涉及多个指标，起动窗口的cascade排列方式不太方便，可从windows菜单改为tili 方式。如果觉得太拥挤，可去掉一个指标，如Frq，这样界面的结构同于Oligo 5.0，只是显
9、示更 清楚了。经过Windows/Tili项后的显示如图：在设计时，可依据图上三种指标的信息选取序列，如果觉 得合适，可点击Tm图块上左下角的Upper按钮，选好上游引物，此时该按钮变成，表示上 游引物已选 取好。下游引物的选取步骤基本同上，只是按钮变成 Lower。?G值反映了序列与 模板的结合强度，最好引物的?G值在5端和中间值比较高，而在3端相对低（如图：）Tm值 曲线以选取72C附近为佳，5到3的下降形状也有利于引物引发聚合反应。Frq曲线 为“Oligo 6” 新引进的一个指标，揭示了序列片段存在的重复机率大小。选取引物时，宜选 用3端Frq值相 对较低的片段。当上下游引物全选好以后
10、，需要对引物进行评价并根据评价对引物进行修改。首先检查引物二聚 体尤其是3端二聚体形成的可能性。需要注意的是，引物二聚体有可能是上游或下游引物自身 形成，也有可能是在上下游引物之间形成（cross dimer）。二聚体形成的能值越高，越不符合 要求。一般的检测（非克隆）性PCR，对引物位置、产物大小要求较低，因而应尽可能选取不形成二聚体或其能值较低的引物。第二项检查是发夹结构（hairpin）；与二聚体相同，发夹结构 的能值越低越好。一般来说，这两项结构的能值以不超过4.5为好。当然，在设计克隆目的的 PCR引物时，引物两端一般都添加酶切位点，必然存在发夹结构，而且能值不会太低。这种PCR 需
11、要通过灵活调控退火温度以达到最好效果，对引物的发夹结构的检测就不应要求太高。第三 项检查为GC含量，以45-55%为宜。有一些模板本身的GC含量偏低或偏高，导致引物的GC 含量不能被控制在上述范围内，这时应尽量使上下游 引物的GC含量以及Tm值保持接近，以 有利于退火温度的选择。如果PCR的模板不是基因组DNA，而是一个特定模板序列，那么最 好还进行False priming site的检测。这项检查 可以看出引物在非目的位点引发PCR反应的可 能性。如果引物在错配位点的引发效率比较高，就可能出假阳性的PCR结果。一般在错配引发 效率以不超过100为好，但对于特定的 模板序列，还应结合比较其在
12、正确位点的引发效率。如 果两者相差很大，比如在正确位点的引发效率为450以上，而在错误位点的引发效率为130， 那么这对引物也是可以接受的。当我们结束以上四项检测，按Alt+P键弹出PCR窗口，其中总结性地显示该引物的位置、产物 大小、Tm值等参数，最有用的是还给出了推荐的最佳退火温度和简单的评价。 由于“Oligo”软 件的引物自动搜索功能与“Primer Premier 5的相类似，并且似乎并 不比后者更好用，在此不再 赘述。其实，使用软件自动搜索引物就是让计算机按照人的要求 去寻找最佳引物，如果参数设 置得当将大大提高工作效率。Oligo使用方法介绍作为目前最好、最专业的引物设计软件，O
13、ligo的功能很强，在这里我们介绍它的一些主要功能： 如：普通引物对的搜索、测序引物的设计、杂交探针的设计以及评估引物对质量等等。在正式进行引物设计前，我们首先面临的一个任务就是向Oligo程序导入模板序列，根据不同的 实验情况，导入模板有三种方法：1，直接用键盘输入：a，点击file菜单中的New Sequence浮动命令，或直接点击工具栏中的New Sequence命令， 进入序列展示窗口；b，此时即可键入DNA序列；c，如果需要的话，Oligo提供碱基回放功能，在边键入时边读出碱基，防止输入错误。点击Edit 菜单中的“Readback on”即可。2，利用复制和粘贴：当我们序列已经作为
14、TXT文件存在或其它oligo不能直接open的文件格 式，如word文件.html格式，这个功能就显得很有用了。在相应文件中复制序列后在序列展示 窗口粘贴，oligo会自动去除非碱基字符。当序列输入或粘贴完成后，点击Accept/Discard菜单 中的Accept浮动命令，即可进入引物设计模式。3，如果序列已经保存为Seq格式或者FASTA，GenBank格式时，oligo就可以直接打开序列文 件。点击File菜单中的“Open”浮动命令，找到所需文件，打开即可。进入引物设计模式后，oligo 一般会弹出三个窗口，分别是6碱基频率窗口，碱基退火温度窗 口以及序列内部碱基稳定性窗口，其中的退
15、火温度窗口是我们引物设计的主窗口，其它的两个窗 口则在设计过程中起辅助作用，比如6一碱基频率窗口可以使我们很直观地看到所设计引物在相 应物种基因组中的出现频率，如果我们的模板是基因组DNA或混合DNA时，该信息就显得有用 了，而内部稳定性窗口则可以显示引物的5端稳定性是否稍高于3端等。一，普通引物对的搜索：以Mouse 4E (cDNA序列)为例。我们的目的是以Mouse 4E (2361 bp )为模板，设计一对引 物来扩增出600 800bp长的PCR产物。1，点击Search菜单中的”For Primers and Probes命令，进入引物搜索对话框；2, 由于我们要设计的是一对PCR
16、引物，因此正、负链的复选框都要选上，同时选上Compatible pairs。在Oligo默认的状态下，对此引物对的要求有：a，无二聚体；b，3端高度特异，GC含量有限 定，d，去除错误引发引物等。3, 剩下的工作是确定上、下游引物的位置及PCR产物的长度以及引物设计参数。 单击：search Ranges”按钮，弹出Search Ranges”对话框。输入上游引物的范围：12000， 下游引物的位置：1002300； PCR产物的长度600800bp。 单击Paramaters”按钮进入Search Parameters”对话框，对话框种分三个活页，分别是：不同 设定，参数以及更多参数。 在普通设定窗口，为我们提供了对引物非常直观的设定方法，从高到低分六个等级，最后还 有一个用户定制选项。 当我们对引物的各种参数的含义及应该设
