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1、链置换扩增术（SDA）及其进展关键词：链置换扩增术；DNA检测摘要 链置换扩增术（strand displacement amplification, SDA）是近几年 发展起来的一种酶促DNA体外等温扩增方法。在靶DNA两端带上被化学修饰的限制 性核酸内切酶识别序列，核酸内切酶在其识别位点将链DNA打开缺口，DNA聚合酶 继之延伸缺口 3端并替换下一条DNA链。被替换下来的DNA单链可与引物结合并 被DNA聚合酶延伸成双链。该过程不断反复进行，使靶序列被高效扩增。本文主要 介绍SDA的原理及其发展。关键词链置换扩增术；DNA检测近几年来，随着分子生物学技术的迅速发展，基于核酸（DNA或RNA
2、）检测的 诊断方法（如各种PCR、Southern杂交和Northern杂交）已大量建立并获得广泛 应用。这给临床诊断提供了快速、灵敏和准确的方法。虽然这些方法在临床实践中 也遇到一些问题，如PCR的假阳性与假阴性问题，但基因诊断具有一些特殊优点， 如：需样量少、快速灵敏和准确、应用范围广泛；因此，众多学者学者不断改进现 有技术探索新方法。新技术如转录依赖的扩增系统（TAS）、自主序列复制（3SR）、循环探针反应、QB复制酶扩增法、快速导流杂交法、DNA凝集反应等陆 续出现。SDA就是在这样的背景下产生发展起来的，与其它的DNA扩增技术相比， SDA有快速、高效、特异的优点且无需专用设备。19
3、92年，美国Becton Dickinson研究中心的Walker等发表了关于SDA的研 究报道，标志一种新的DNA扩增技术SDA的诞生1。人们也在不断对SDA进行改 良。用BsoB I代替HincII和采用exo-Bca酶代替exo-Klenow酶建立了嗜热SDA（thermophilic sDA），并以荧光偏振（Fluorescence Polarization，FP）检测 技术代替电泳法作为SDA产物检测方法，使SDA检测更快速、灵敏且可定量。2 SDA的原理SDA是一种基于酶促反应的DNA体外等温扩增技术1。其基本系统包括一种 限制性核酸内切酶、一种具有链置换活性的DNA聚合酶、两对引
4、物、dNTP以及 钙、镁离子和缓冲系统。其基本过程包括准备单链DNA模板、生成两端带酶切位点 的目的DNA片段、SDA循环三个阶段。SDA中所用核酸内切酶的切割位点需专一，对识别位点的化学修饰敏感且在打 开缺口后能立即解离让位于DNA聚合酶，如HincII、HindII ；所用DNA聚合酶有 链置换生活，但没有核酸外切酶活性（如cxo-Klenow）。因为3-5外切酶活 性会使引物单链在反应中降解；53外切酶活性会使引物-靶序列杂交体中的 5悬端水解。DNA聚合酶需满足如下条件才能用于SDA反应：无外切核酸酶活 性；于缺口处启动反应；可利用dNTPas;具有链置换活性。以上两种酶最好 是耐热毒
5、，如BsobI和exo-Bca酶，以便提高SDA反应的温度以缩短反应时间、 提高反应效率和提高SDA的特异性。应用BsoB I和exo-Bca酶的SDA称嗜热SDA， 能于20分钟内将靶DNA扩增1010倍，所用dNTP中有一种是经化学修饰的核苷酸 （如dCTPas） 一根据所用核酸内切酶的不同而不同。采用修饰核苷酸的目的是在SDA中形成修饰的核酸内切酶识别位点，使核酸内切酶不能切断双链DNA而只将其 打开缺口。所用两对引物(Bl, B2与S1, S2)中有一对(Bl, B2)只含与靶片段 互补的序列，而另一对(S1, S2)除含与靶片段互补的序列外，还在其5端含所 用核酸内切酶的识别序列(如
6、BsoB I的识别序列为5 -TCGGG)，且S1 (S2)在 模板上的结合位点位于模板上Bl (B2)结合位点的5侧。2.1制备单链DNA模板 用热解链法制备单链DNA模板可避免影响SDA体系的 pH。其它制备方法如酶解链法未见报道。该阶段实际上只是在为SDA准备模板。2.2两端带酶切位点的目的DNA片段的生成该阶段通过3次引物延伸和2次置 换反应，以单链DNA为模板制备两端酶切位点的双链DNA片段。Bl (B2)与S1(S2)分别结合在模板上相应结合位点并在DNA聚合酶作用下延伸其3端；在B1 (B2)延伸的同时，将由S1 (S2)延伸所形成的链置换下来；置换下来的链 (T1)的5端含S1
7、 (S2)序列，继续参与反应：而Bl (B2)与原始模板形成的 双链则不再参与反应。T1含B2 (B1)和S2 (S1)的互补序列，与B2 (Bl)、S2(51) 结合并经特定DNA聚合酶的延伸和替换，获得一条5端S2 (S1)序列且 3端含S1 (S2)互补序列的单链DNA (T2)。B2 (B1)与T1形成的双链亦不再参 与反应。T2再与S1 (S2)结合并被DNA聚合酶延伸，从而形成两端均带有特定限 制性核酸内切酶识别序列的双链DNA。该阶段无放大作用，是等摩尔反应。2.3SDA循环在此阶段，靶序列才被迅速放大。限制性核酸内切酶在其识别位 点S1 (S2)处将双链DNA打开缺口，DNA聚
8、合酶延伸该切口的3残端并替换下一 条5端含部分S1 (S2)序列、3端含S2 (S1)互补序列的单链DNA (T3)。T3 与S2 (S1)结合并引导延伸而形成一条一端含S2 (S1)序列、另一端含部分S1(52) 序列的双链DNA。核酸内切酶又可在其识别位点S2 (S1)处将双链DNA打开 缺口并通过DNA聚合酶的延伸和替换而获得一条5端含部分S2 (S1)序列3端 含部分S1 (S2)互补序列的单链DNA (T4)。T4部分S1 (S2)互补序列，可与S1(S2)结合，DNA聚合酶延伸T4-S1 (S2)复合物的两个3残端而形成一条一端 含S1 (S2)序列，另一端含部分S2 (S1)序列
9、的双链DNA。限制性核酸内切酶的 切割、DNA聚合酶的延伸和替换、引物的延伸。如经反复进行，使SDA构成循环反 应。在DNA聚合酶延伸、替换生成单链的同时亦生成一条双链的DNA。该双链DNA 可再被切割、延伸替换，并又有同一双链生成，从而构成SDA的双链循环。由于在 SDA中单、双链都不断循环，故靶片段得以高效扩增。3 DNA的研究进展Walker等将由HincII、exo-Klenow酶所组成的SDA系统用于扩增结核分枝杆 菌IS6110 dNA片段，在37C孵育2h,获得108倍扩增。1994年，Walker等在原 单靶SDA (只对一靶片段进行扩增的SDA)的基础上将SDA的扩增序列拓展
10、为两 个，即建立了复合 SDA(Multiplex sDA)2。Walker 等使用由 HincII 和 exo- Klenow酶所组成的复合SDA系统(40C孵育2h)成功地使结核菌IS6110和分枝菌 16S dNA片段都获得108倍扩增2。之后，Walt er, Zwadyk, Litt le等对SDA的 引物特异性等与PCR作了比较3-7。但并没使SDA技术本身有多在发展。1996年 SDA发展最迅速的一年，无论是SDA系统还是SDA产物检测方法都有较大革新。3.1SDA产物检测方法的进展Walker等将荧光技术引入SDA产生检测，建立了 SDA的荧光偏振(Fluorescence p
11、olarization, FP)检测手段4；该技术解决了 用电泳检测SDA产物的拖尾问题，比电泳法更灵敏、快速且能定量。在SDA和FP 检测技术中，一种5端标记有荧光素的寡核苷酸探针被加入到SDA产物中，该荧 光探针本身只有很弱的荧光效应，而一旦与相应互补序列形成双链，荧光效应就会 大大增强。因此，通过检测荧光强度的增加就可得出SDA产物中靶DNA的含量。当 加入一种DNA结合蛋白(如只有结合活性而无切割活性的EcoRI )，可使该法获 得更满意的效果8, 9。1997年Spears等将荧光探针加入到SDA循环中，建立了 同步SDA荧光偏振检测技术(simu taneous sDA and F
12、P de tec tion) 10，用于检 测沙眼衣原体获得成功。之后，FP就成为SDA产物检测的主导方法。也可通过DNA 聚合酶延伸同位素标记的探针来检测。3.2SDA系统的改进Spargo等于1996年报道用BsobI代替HincII，用缺乏 5f3核酸外切酶活性的exo-Bca酶代替exo-Klenow酶组成嗜热SDA (therm ophilic SDA)系统11，将反应温度提高到60C而时间则缩短到15min,且扩增 效率提高100倍，而且使SDA产物更加专一，非特异扩增降低11。将嗜热SDA与 FP结合的DNA检测技术能在30min内检测出极低含量的靶DNA,使SDA成为极具应 用
13、前景的核酸检测技术。在SDA的临床应用方面，Down等和Ichiyama等人进行了一些有益的探索。 Down等采用化学发光的方法对294例临床收集的痰标本进行了 TBIS6110的检验， 并根据校正曲线换算成相应的结核杆菌数目12。他们得出的初步结论是SDA可用 于临床标本的结核杆菌检测。Ichiyama等人做了 SDA与PCR和培养法检测结核杆 功物临床对比实验13在用SDA、PCR和培养法对299位病人的530例痰标本进行 结核杆菌检验的实验中，以细菌培养法作参考，SDA灵敏度为94.7%, PCR的灵敏 度为89.5%, PCR的特异性为100%Ichiyama等据此认为，在临床上检测痰
14、标本中 的结核杆菌方面，SDA应当是一种很有用的方法。4 SDA的不足一是SDA产物不均一。由于在SDA循环中总要产生一些不同的单、双链产物， 这使得用电泳法检测SDA扩增产物时必然要出现拖尾现象。尽管有不少学者试图通 过调节钙、镁离子浓度以及酶的用量来改善7,但由于这是SDA的必然产物，目 前的技术不可能根本消除。二是SDA产物的两端必然带有所用核酸内切酶的识别序 列或其残端，因而SDA产物不可能直接用于克隆。这使得SDA在基因工程方面没有 优势。三是目前SDA产物的检测手段尚不够如意。目前SDA产物检测的主导方法是 荧光偏振检测法。但该检测方法需要特殊仪器一一荧光分光光度计，这限制了 SD
15、A 在临床的广泛应用。另外，SDA可能因标本中含有不明抑制物，使检测不能反映标 本中靶DNA的真实含量。复合DNA中高含量靶DNA对低含量靶DNA的竟争抑制现象 也很常见。5 SDA的应用前景如前所述，对SDA检测技术的研究已有取得可喜的成绩。嗜热SDA的建立并与 FP结合，使高灵敏度、快速特异的SDA检测成为现实。最近，Mehrpouyan等人用 SDA检测HIV-1 rNA获得成功14，这说明SDA可用于所有核酸的检测。总之，虽 然SDA尚有不如人意的地方，但随着其不断迅速发展，可以相信，SDA将成为临床 疾病的诊治和科学研究的有用手段。参考文献1 Walker GT，Fraiser MS
16、，Schram JL，et al.Nucleic Acids res， 1992;20(7):1691-62 Walker GT，Nadeau JG，Spears PA，et al.Nucleic Acids res， 1994;22(13):2670-73 Walker GT，Nadeau JG，Linn CP，et al.Clin Chem，1996;42(1):9-134 Walker GT，Nadeau JG amd Linn CP.Mol cell-Probes，1995;9(6)399-4035 Walter NG.J Mol Biol，1995;254(5):856-686 Little MC，Sears PA and Shank DD.Mol Cell probes，1994;8(5)375-847 Zwadyk
