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1、. . .*标准操作规程文件细菌毒素检查法文件SOP/QC-043(1)-2015共 10 页名称编号第 1 页部门：QC新订：替代：SOP/QC-043(1)-2013起草人审核人批准人颁发部门QA起草日期审核日期批准日期生效日期分发部门总经理、质量部、QC目的建立细菌毒素检查操作规程，保证检测结果的准确性。适用围所有原料、成品的细菌毒素检查。责任人QC检验员容1 简述1.1 本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌毒素，以判断供试品中细菌毒素的限量是否符合规定的一种方法。1.2 细菌毒素检查包括凝胶法和光度测定法两种方法。供试品检测时可使用其中任何一种方法。当测定结果有争议时，除
2、另有规定外，以凝胶法结果为准。1.3本规适用于凝胶法检查。凝胶法系通过鲎试剂与毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量毒素的方法。1.4 细菌毒素的量用毒素单位(EU)表示1.5 细菌毒素国家标准品(NSE)系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌毒素工作标准品的效价。1.6 细菌毒素工作标准品(WSE)系以细菌毒素国家标准品为基准标定其效价，用于试验中的鲎试剂灵敏度复核、干扰试验与各种阳性对照。1.7 凝胶法细菌毒素检查用水(BET水)系指毒素含量小于0.015Eu/ml灭菌注射用水。光度测定法用的细菌毒素检查用水，其毒素的含量应小于0.005Eu/ml。1.8 鲎
3、试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的毒素*标准操作规程文件细菌毒素检查法文件SOP/QC-043(1)-2015共 10 页名称编号第 2 页的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度,用EU/ml表示。当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。1.9 供试品干扰试验项用于建立新品种细菌毒素检查方法以与供试品的配方和生产工艺或试验环境有变化，鲎试剂来源不同或供试品阳性对照结果呈阴性时确定供试品是否存在抑制或增强作用。1.10 检查法项为供试品细菌毒素检查方法。阴性对照、阳性对照和供试品阳性对照必须同时进行，否则试验结果无效。2
4、 实验材料与用具2.1 天平 供试品称量用，感量为0.1mg以下。 2.2 电热干燥箱 除外源性毒素用，温度应能维持250以上至少一小时。2.3 恒温水浴箱或适宜的恒温器，应能在37土1保持一小时。2.4 水银温度计或酒精温度计，精度在1以下。2.5 旋涡混合器2.6 鲎试剂(应具有国家主管部门的批准文号)与细菌毒素检查用水(符合规定)。2.7 细菌毒素国家标准品(NSE)，细菌毒素工作标准品(WSE)，除另有规定外应由中国药品生物制品检定所统一发放。2.8 实验用具 移液管(或刻度吸管，定量移液器)、凝集管(10 75mm)、三角瓶、小试管(16100mm)、试管架、洗耳球、封口膜或金属试管
5、帽、时钟、脱脂棉、吸水纸、剪刀、砂轮所用玻璃器皿须经250干烤至少1小时。塑料用具应使用其它适宜的除细菌毒素方法。2.9 试剂 75%乙醇、蒸馏水、5%重铬酸钾硫酸洗液。3 操作方法3.1 试验准备3.1.1 洗液的配制 配制铬酸洗液或其他适宜的细菌毒素灭活剂。3.1.2 玻璃器皿的洗涤 将被洗涤的玻璃器皿用洗涤剂和自来水洗净并空干水分后置洗液中浸泡4小时，取出将洗液滤干，用自来水将残余的洗液洗净，再用新鲜蒸馏水冲洗干燥后置适宜的密闭金属容器中，迅速置烤箱中。*标准操作规程文件细菌毒素检查法文件SOP/QC-043(1)-2015共 10 页名称编号第 3 页3.1.3 除去玻璃器皿表面可能存
6、在的外源性毒素 玻璃器皿置烤箱后将烤箱调至250，待烤箱温度升至设定的温度后开始记时，须干烤至少1小时。达到规定时间后，关断电源。待烤箱温度自然降至室温，在不开启金属容器的情况下，可在两周使用，否则须再次加热除去可能存在的外源性毒素。3.2 毒素限值的确定药品、生物制品的细菌毒素限值(L) 一般按以下公式确定 L=K/M式中 L为供试品的细菌毒素限值，以EU/ml、EU/mg、或EU/U(活性单位)表示；K为人每公斤体重每小时最大可承受的毒素剂量，以EU/(kgh)表示，注射剂，K=5EU/(kgh)，其中放射性药品注射剂K2.5EU/(kgh)，鞘用药品，K=0.2EU/(kgh)；M为人用
7、每公斤体重每小时最大供试品剂量，以ml/(kgh)、mg/(kgh)或U/(kgh)表示，人均体重按60kg计算，注射时间若小于l小时，按l小时计。 按人用计量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。3.3 确定最大有效稀释倍数(MVD) 最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许稀释的最大倍数，在不超过此稀释倍数的浓度下进行毒素限度的检测。用以下公式来确定MVD： MVD=CL/L为供试品的细菌毒素限值；C表示供试品的浓度，或供试品复溶后所得溶液的浓度。当L以EU/ml表示时C为1.Oml/m1，当L以EU/mg或EU/u表示时，C单位需为mg/ml
8、或u/ml。如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=/L；为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度(EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的毒素浓度。3.4 鲎试剂灵敏度复核3.4.1 毒素标准溶液的制备3.4.1.1 取NSE或WSE一支，轻弹瓶壁，使粉末落人瓶底，再用砂轮在瓶颈上部轻轻*标准操作规程文件细菌毒素检查法文件SOP/QC-043(1)-2015共 10 页名称编号第 4 页划痕，75%酒精棉球擦拭后启开，防止玻璃屑落入瓶。3.4.1.2 按标准品使用说明书用移液管加入规定量的BET水溶解其容物，用封口膜将瓶口封严。置旋涡混合器上混
9、合15分钟，然后制备成所需浓度的细菌毒素标准溶液即2.0、1.0、0.5、0.25(为所复核鲎试剂的标示灵敏度)，每稀释一步均应在旋涡混合器上混合30秒(详细过程请参见使用说明书)。若为NSE，可按其使用说明书将其稀释至规定浓度后分装并保存。例如使用NSE(毒素含量为9000EU支)时的方法如下： 复溶：准确吸取BET水1ml加入NSE的安瓿，用封口膜将瓶口封严，置旋涡混合器混合15分钟，即为9000EU/ml毒素标准溶液。 稀释：取0.3ml毒素标准溶液加上2.7mlBET水即为110稀释液，得到900EU/ml毒素标准溶液。 取0.3mll10稀释液，加上2.7mlBET水即为1100稀释
10、液，得到90EU/ml毒素标准溶液。 往后依次类推。也可写成以下格式： 0.3ml 0.3ml 0.3ml 0.3ml 1ml 1ml 9000EU/ml900EU/ml90EU/ml9EU/mllEU/ml0.5EU/ml 2.7ml 2.7ml 2.7ml 2.4ml lml lml lml lml lml 0.25EU/ml0.125EU/ml0.0625EU/ml0.03125EU/ml lml lml lml在上述稀释过程中，每稀释一步，均须在旋涡混合器上混合30秒钟。3.4.2 待复核鲎试剂的准备3.4.2.1 在制备毒素标准溶液的同时，取0.1ml/支的鲎试剂18支轻弹瓶壁，使粉
11、末落入瓶底。用砂轮在瓶颈轻轻划痕，75%乙醇棉球擦拭后启开备用，防止玻璃屑落人瓶，加入0.1mlBET水复溶，使容物充分溶解，避免产生气泡。3.4.2.2 若待复核鲎试剂的规格不是0.1ml/支时，按标示量加入BET水复溶，将复溶后的鲎试剂溶液混匀后每0.1m1分配到10mm 75mm凝聚管中，要求至少分配18管*标准操作规程文件细菌毒素检查法文件SOP/QC-043(1)-2015共 10 页名称编号第 5 页备用(或取0.1ml/支的鲎试剂溶液的10mm75mm试管或复溶后的0.1ml/支的鲎试剂原安瓿)。3.4.3 加样 将已充分溶解的待复核：鲎试剂18支(管)放在试管架上，排成5列，其
12、中4支(管)4列分别加入2.0、1.0、0.5、0.25的毒素标准溶液；2支(管)l列分别加入BET水作为阴性对照。毒素标准溶液和BET水的加样量均为0.lml/支。3.4.4 加样完毕后、用封口膜封口，轻轻混匀，避免产生气泡，连同试管架放人37士l水浴或适宜恒温器中，试管架保持水平状态，保温602分钟，观察结果。 3.4.5 将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管形成凝胶，并且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、变形、并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动造成假阳性结果。3.4.6 鲎试剂灵敏度复核实验结果计算当最大浓度2.0管均为阳性，最
13、低浓度0.25管均为阴性，阴性对照为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均值，即为鲎试剂灵敏度的复核结果(C)。C=lg-1()式中X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是系列浓度递减的毒素溶液中最后一个呈阳性结果的浓度。 当C在0.52(包括0.5和2)时，方可用于细菌毒素检查，并以标示灵敏度为该批鲎试剂的灵敏度。3.5 干扰试验 3.5.1 按表1制备溶液A、B、C和D，使用的供试品应为未检验出毒素且不超过最大有效稀释倍数(MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。3.5.2 只有当溶液A和阴性对照溶液D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂灵敏度复
14、核围时，试验方为有效。按下式计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值(E0和E1)*标准操作规程文件细菌毒素检查法文件SOP/QC-043(1)-2015共 10 页名称编号第 6 页式中 X0、X1分别为系列溶液C和溶液B的反应终点浓度的对数值(lg)。 当E0在0.52(包括0.5和2)与E1在0.5 E02 E0(包括0.5 E0和2 E0)时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。3.5.3 表1 凝胶法干扰试验溶液的制备编号毒素浓度/配制毒素的溶液稀释用液稀释倍数所含毒素的浓度平行管数A无/供试品溶液-2B2/供试品溶液供试品溶液1248
