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1、 利用MTT法测定盐酸氮芥对HELA细胞增殖的抑制效果 摘要 目的：研究盐酸氮芥对HELA细胞增殖的影响；方法：MTT比色法；结果：不同浓度的盐酸氮芥对HELA细胞增殖均有抑制作用，其抑制率和剂量呈良好的线性关系。随着盐酸氮芥浓度的上升，抑制作用越强，HELA细胞的存活率下降，其抑制率和剂量呈正相关。最强的抑制效果是浓度为80g/ml的盐酸氮芥。说明盐酸氮芥能够抑制HELA细胞的分裂和增殖。讨论：实验应设计添加一个平行实验，测定同样的浓度梯度的盐酸氮芥对正常细胞生长和增殖的影响，比较其毒害正常细胞的程度。关键词 盐酸氮芥、MTT、Hela细胞、增殖抑制The Inhibitory Effect
2、 of Hela cells proloferation in Chlormethine Hydrochloride By MTT Colorimestry Abstract Objective: To study the HELA chlormethine hydrochloride on cell proliferation; Methods: MTT colorimetry; Results: Different concentrations of hydrochloric acid nitrogen mustard on HELA inhibit cell proliferation,
3、 and its inhibition rate and the dose was a good linear relationship. With the rise of chlormethine hydrochloride concentration, the stronger the inhibition, HELA cells, the survival rate of decline, and its inhibition rate and dose were positively correlated. The strongest inhibitory effect of the
4、concentration of 80g/ml chlormethine hydrochloride. Note HELA chlormethine hydrochloride can inhibit cell division and proliferation. Discussion: The experiment should be designed to add a parallel experiment, determination of the same concentration gradient of chlormethine hydrochloride on normal c
5、ell growth and proliferation, compared to the level of toxicity in normal cells.Keywords chlormethine hydrochloride, MTT, hela cells, growth inhibition目前治疗恶性肿瘤的药物有多类化合物，如氮芥类、嘧啶类、铂类、卟啉类1等。在各种抗肿瘤药物中，氮芥类化合物是使用较早而义重要的一类抗肿瘤药。此类药物合成简便，成本低廉，迄今已有70多种包括烷基类、芳基类、磷酰胺类等多类氮芥化合物作为抗肿瘤药物应用于临床，在肿瘤的治疗中占有重要的地位。氮芥类抗肿瘤药物
6、是一氯乙胺类化合物的总称，包括单-氯乙胺类和双-氯乙胺类等。一般认为该类药物的作用机制是通过在体内形成高度活泼的乙撑亚胺离子或碳正离子，成为亲电性的强烷化荆，进而与生物大分子(如DNA、RNA或某些重要的酶类)中的富电子基团(如羟基、氨基、羧基、磷酸基等)发生共价结合，使其丧失活性或使DNA分子发生断裂，从而达到抗肿瘤目的。氮芥类化合物作为重要的一类抗肿瘤药物，已有多种用于临床。纵观其结构，氮芥类抗肿瘤化合物一般分为两部分：烷基化部分和载体部分。烷基化部分是抗肿瘤活性的功能基，载体部分町以用以改善该类药物在体内的吸收、分布等药动学性质，从而影响药物的毒性、选择性和抗肿瘤活性。因此选用不同载体的
7、氮芥类药物设计具有重要的意义。氮芥类化合物合成较为简便，成本低廉，已用于临床的氮芥类药物较多，但仍存在不良反应大、治疗效率低、选择性差等缺点，这些极大地吸引和鼓励着无数研究工作者致力于氮芥类化合物的研究与开发以便获得高效低毒选择性高的抗肿瘤药物。特别是近几年，对抗癌药物的需求更为迫切，国内外对氮芥类化合物的研究更为活跃，每年都有不少新型结构的氮芥衍生物报道2。本次实验使用的是氮芥类药物是盐酸氮芥（英文名：Chlormethine Hydrochloride Injection）。其为双功能烷化剂，主要抑制DNA合成，同时对RNA和蛋白质合成也有抑制作用。它的作用机理是氮芥可与鸟嘌呤第7位氮呈共
8、价结合，产生DNA的双链内交叉联结或DNA的同链内不同碱基的交叉联结，阻止DNA复制，造成细胞损伤或死亡2。具有强烈的细胞毒作用，选择性差，对增殖细胞和非增殖细胞的作用近似。对肿瘤细胞的G1期和M期杀伤作用最强，大剂量时对各期细胞均有杀伤作用，属细胞周期非特异性药物。动物实验证实氮芥对大鼠金生肉瘤、瓦克癌肉瘤256、吉田肉瘤腹水型、小鼠淋巴瘤、蕈样肉芽肿以及肺癌有明显抑制作用，对未分化癌疗效好而快，与VCR、甲基苄肼等合用治疗何杰金氏病有较高的疗效。对卵巢癌、乳腺癌、绒癌、前列腺癌、精原细胞癌和鼻咽癌（半身化疗法）等也有一定的疗效。对动物毒性主要表现为明显的胃肠道反应和骨髓抑制。本文采用细胞培
9、养技术，通过细胞培养法、MTT比色法，观察不同浓度梯度的盐酸氮芥对HELA细胞（宫颈瘤细胞系)生长的抑制作用，研究该药物抗肿瘤作用。前言太长，有关氮芥的结构、性质等可以在讨论中写。你参考一下已经发表的文章，没有几个文章的前言会写这么复杂。前言的目的就是告诉别人你要做什么。1 材料与方法11 药物、试剂及配置(1)盐酸氮芥：用10DMSO(二甲亚砜)配置成1104 mol/L浓度；(2)胎牛血清(FCS)：56 OC，30分钟灭活；(3)MTT试剂：称取0.5克MTT，溶于100ml的磷酸缓冲液（PBS），用0.22um滤膜过滤除去溶液里的细菌，放4 OC避光保存。（现配现用）12 靶细胞 美国
10、购入的海拉宫颈瘤细胞系（HELA 细胞），实验室传代保种。13 液体抑制试验细胞以46103个等量接种于96孔板，将药物盐酸氮芥接种浓度设定为梯度分别为5、10、20、40、80g/mL，对照组加等量的RPMI 1640每组设4个平行样本,37 oC ,5CO2 饱和湿度培养48小时。15 MTT比色法实验（1）接种：收集对数期细胞。调整细胞悬液浓度，使细胞浓度为23104/ml,每孔加入细胞悬液200l,使每孔内的细胞数为40006000个。（2）培养与药物处理：培养箱继续培养24h,吸出培养液加入不同浓度梯度的盐酸氮芥200l，每个浓度有4个孔作为平行对照。（3）呈色：培养箱内继续培养到第
11、3天，于倒置显微镜下观察细胞生长情况后，每孔加5mg/ml的MTT溶液20l，继续孵育4h，终止培养：快速翻转培养板，弃去孔内培养上清液：然后每孔加DMSO 150l，振荡（摇床）30min，使结晶物充分溶解。（4）比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。（5）计算和分析：计算盐酸氮芥处理对细胞增殖率的影响。细胞增殖率=（未加药物处理的对照组吸光值药物处理组的吸光值）/未加药物处理的对照组吸光值。值为+时说明药物对细胞增殖有抑制作用；值为0是说明药物对细胞增殖无影响；值为-时说明药物对细胞增殖有促进作用。2 结果与分析2. 1 不同浓度梯度的盐酸氮芥对HELA细
12、胞增殖率（MTT代谢）的影响(表2) 表1：盐酸氮芥能显著抑制HELA细胞对MTT的代谢，抑制率与剂量呈正相关。表一 不同浓度梯度盐酸氮芥对HELA细胞增殖率的影响盐酸氮芥浓度空白对照5g/ml10g/ml20g/ml40g/ml80g/ml490nm分光光度值0.0600.7170.5320.2210.1800.1790.1770.055 0.699 0.477 0.234 0.182 0.203 0.172 0.063 0.824 0.495 0.210 0.190 0.190 0.176 0.059 0.747 0.501 0.222 0.184 0.191 0.175 0.688 0.
13、442 0.163 0.125 0.132 0.116 盐酸氮芥对HELA细胞的抑制率35.71%76.36%81.83%80.86%83.14%2.2分析由此表一可得，不同浓度的盐酸氮芥对Hela细胞的抑制率不同，体外MTT的试验表明，本组实验设置的各个浓度均对细胞有不同的抑制效果，且在本组设置的浓度范围内，细胞的抑制率与盐酸氮芥的浓度成正相关（见表二、三），随着盐酸氮芥浓度的上升，HELA细胞的存活率越少（抑制率越大）。对HELA细胞增殖的抑制率最高（抑制HELA细胞增殖效果最强）的均落在浓度为20g/ml、 40g/ml、 80g/ml这一范围内，而在40g/ml的盐酸氮芥浓度下，HEL
14、A细胞的抑制率比另外两个相近浓度的稍有回落，证明2080g/ml这一浓度范围内，对HELA细胞增殖有最强抑制效果的浓度要确定它的具体数值还需要进行更细的浓度梯度设置，例如设置一组浓度梯度为20g/ml、25g/ml、30g/ml、35g/ml、40g/ml和一组浓度梯度为40g/ml、50g/ml、60g/ml、70g/ml、80g/ml的实验处理组。在本实验里，HELA细胞增殖率最大的为添加盐酸氮芥浓度80ug/ml的培养液，其平均抑制率为83.14%，超过半数抑制效应。3 讨论本实验结果表明，结果提示上述药在体外均有明显的抗肿瘤作用，其抑制率和剂量呈良好的线性关系，并且盐酸氮芥对肿瘤细胞具
15、有明显的抑制作用，其抑制率和剂量呈正相关说明此药能够抑制细胞的分裂和增殖。目前，使用非集落实验测定肿瘤细胞对抗癌药物敏感性的方法越来越受到重视4。Mosman首创了MTT比色分析法5 ，这一实验技术可通过测定线粒体能量代谢，以反映细胞增殖情况，MTT测定是细胞内的线粒体酶可将黄绿色的MTT降解形成蓝紫色甲瓒，用酶联免疫检测仪测定甲瓒的含量来定量测定细胞的存活比例6,7。测定了盐酸氮芥对HELA细胞的抑制作用，抑制率与剂量呈正相关。 烃化剂代表抗肿瘤药最重要的类型之一，由于其大部分药物为化学合成的小分子，易进入肿瘤组织，且对富氧细胞与缺氧细胞具有相等毒性，因此是临床上治疗实体瘤常用的一类有效抗癌药8。盐酸氮芥现代药理和临床应用都表明具有明显的抗肿瘤作用 ，但由于其毒性较大，而且在水中较易分解 ，故限制了临床应用。下步的继续研究可探讨合成的氮芥异构体减轻氮芥的毒性及副作用，提高其抗肿瘤的作用9。并且很遗憾的是，在目前临床使用的大多数抗肿瘤药物无严格选择性，它们在杀伤肿瘤细胞的同时也大量杀伤机体内增殖旺盛的细胞，如造血细胞 、肠上皮细胞等，引起造血障碍，机体抵抗力下降，因此，从体内外两方面研究药物对肿瘤和造血细胞的作用是评价
